用于纯化靶物多肽的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102421794A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102421794A(43)申请公布日2012.04.18(21)申请号201080019922.7(51)Int.Cl.(22)申请日2010.05.04C07K14/435(2006.01)C07K1/22(2006.01)(30)优先权数据09159710.42009.05.07EP(85)PCT申请进入国家阶段日2011.11.07(86)PCT申请的申请数据PCT/EP2010/0560102010.05.04(87)PCT申请的公布数据WO2010/128033EN2010.11.11(71)申请人诺维信公司地址丹麦鲍斯韦(72)发明人J.基塞-安德森L.温瑟尔(74)专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人史悦权利要求书2页说明书28页附图8页(54)发明名称用于纯化靶物多肽的方法(57)摘要本发明涉及用于纯化靶物分子的方法，包括下述步骤：(a)将靶物分子和靶物结合多肽(TBP)的群体在溶液中接触充足时间以允许复合物形成；和(b)通过后续纯化步骤从来自(a)的复合物分离所述靶物，其中(i)所述靶物结合多肽具有至少两个结合官能度；第一个结合官能度针对靶物，而第二个结合官能度针对包含于固体支持物中的捕捉配体；和(ii)所述第一结合官能度包含至少两个针对靶物的结合位点，且所述靶物包含至少两个针对TBP的结合位点。CN102479ACCNN110242179402421806A权利要求书1/2页1.一种用于纯化靶物分子的方法，包括下述步骤：(a)将靶物分子和靶物结合多肽(TBP)的群体在溶液中接触充足时间以允许复合物形成；和(b)通过后续纯化步骤从来自(a)的复合物分离所述靶物，其中(i)所述靶物结合多肽具有至少两个结合官能度；第一个结合官能度针对所述靶物，而第二个结合官能度针对包含于固体支持物中的捕捉配体；和(ii)所述第一结合官能度包含至少两个针对所述靶物的结合位点，且所述靶物包含至少两个针对TBP的结合位点。2.权利要求1的方法，其中所述TBP群体仅包含相同的TBP。3.权利要求1的方法，其中所述TBP群体包含结构和/或功能上不同的TBP。4.前述任一项权利要求的方法，其中所述复合物形成是在复合物促进缓冲液的存在下进行的。5.权利要求4的方法，其中所述缓冲液包含用于i)降低水活度，ii)pH稳定化和iii)防止非特异性或随机蛋白相互作用和沉淀并增加一般性蛋白溶解度的试剂。6.权利要求5的方法，其中所述用于降低水活度的试剂包括硫酸铵、羊脂酸(辛酸)、右旋糖酐、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、透明质酸、壳聚糖及其酯，球状多元醇如聚蔗糖(ficoll)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。7.权利要求6的方法，其中PEG包括具有1,000至10,000Da平均分子量的1-10％(w/v)PEG。8.权利要求4-7任一项的方法，其中所述缓冲液包括中性、阴离子型、阳离子型和嵌段共聚物去污剂或表面活性剂。9.权利要求8的方法，其中所述缓冲液包括浓度低于2％的NP40去污剂，Tween20，Tween40或Pluronics家族。10.权利要求4-9任一项的方法，其中pH稳定剂包括磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液和Good缓冲液。11.权利要求10的方法，其中所述Good缓冲液选自下组：pH5-8的Tris、Hepes和MES缓冲液。12.前述任一项权利要求的方法，其中优化靶物分子对TBP的比例以允许最优的复合物形成。13.前述任一项权利要求的方法，其中所述第一结合官能度包含至少三个针对靶物的结合位点，和/或所述靶物包含至少三个针对TBP的结合位点。14.前述任一项权利要求的方法，其中所述包含于第一结合官能度中的至少两个或三个结合位点在功能上是不同的。15.前述任一项权利要求的方法，其中靶物分子对TBP的比例是通过测量复合物形成来优化的。16.前述任一项权利要求的方法，其中复合物形成是通过分光光度测定法来测量的。17.权利要求16的方法，其中复合物形成是通过比浊法或浊度法测量的。18.前述任一项权利要求的方法，其中优化靶物分子对TBP的比例，并在复合物形成步骤过程中监视和控制该比例。19.前述任一项权利要求的方法，其中从复合物分离所述靶物是通过将所述靶物-TBP复合物捕捉于支持物之上，然后从该支持物洗脱靶物分子来获得的。2CCNN110242179402421806A权利要求书2/2页20.权利要求1-19任一项的方法，其中从复合物分离所述靶物是通过进行沉淀或离心，然后溶解所述复合物，将TBP捕捉于固体支持物之上，并收集靶物分子来获得的。21.前述任一项权利要求的方法，其中复合物形成等价于通过比浊法测量时光密度至少