集成的单细胞测序.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106460051A(43)申请公布日2017.02.22(21)申请号201580024133.5克里斯蒂安·F·约翰逊(22)申请日2015.05.08马克·A·恩格(30)优先权数据(74)专利代理机构北京安信方达知识产权代理61/990,5982014.05.08US有限公司1126262/079,4952014.11.13US代理人李平郑霞(85)PCT国际申请进入国家阶段日(51)Int.Cl.2016.11.08C12Q1/68(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2015/0299862015.05.08(87)PCT国际申请的公布数据WO2015/172080EN2015.11.12(71)申请人富鲁达公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人詹森·A·A·韦斯特布赖恩·福勒曾子豪权利要求书4页说明书21页附图19页(54)发明名称集成的单细胞测序(57)摘要本公开内容提供形成加标签的核酸序列的方法。将靶多核苷酸固定在固体支持物上；将识别寡核苷酸与其杂交；裂解该识别寡核苷酸-靶多核苷酸杂合体；和将接头核酸连接到裂解的靶多核苷酸，从而形成加标签的核酸序列。还提供了形成加标签的单链cDNA的方法；形成多个加标签的异质核酸序列的方法；识别寡核苷酸的文库；和用于扩增固定在固体支持物上的cDNA序列的方法。这些方法和产物可单独使用或组合使用用于集成的单细胞测序，并可适合用在微流体设备或装置中。CN106460051ACN106460051A权利要求书1/4页1.一种形成加标签的核酸序列的方法，所述方法包括：(i)将靶多核苷酸固定在固体支持物上，从而形成固定的靶多核苷酸；(ii)将识别寡核苷酸与所述固定的靶多核苷酸杂交，从而形成识别寡核苷酸-靶多核苷酸杂合体；(iii)用裂解剂裂解所述识别寡核苷酸-靶多核苷酸杂合体，从而形成包含裂解的靶多核苷酸的裂解的识别寡核苷酸-裂解的靶多核苷酸杂合体；和(iv)连接接头核酸序列到所述裂解的靶多核苷酸，从而形成加标签的核酸序列。2.根据前述权利要求所述的方法，其中步骤(i)的所述固定包括：(a)将RNA分子捕获到固体支持物，从而形成捕获的RNA；和(b)逆转录所述捕获的RNA，从而形成固定于所述固体支持物的靶多核苷酸。3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述靶多核苷酸是单链cDNA。4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述固体支持物包括珠结构。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述珠结构是生物素珠。6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中第一锚多核苷酸共价结合于所述固体支持物。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一锚多核苷酸包括第一扩增核酸序列。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一锚多核苷酸还包括第一释放核酸序列。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一释放核酸序列连接所述第一扩增核酸序列到所述固体支持物。10.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述第一释放核酸序列包括限制性酶裂解序列。11.根据权利要求3所述的方法，其中所述cDNA经由第二锚多核苷酸连接于所述固体支持物。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二锚多核苷酸包括靶多核苷酸捕获序列。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶多核苷酸捕获序列是脱氧-胸腺嘧啶序列。14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述第二锚多核苷酸还包括第二扩增核酸序列。15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述第二锚多核苷酸还包括第二释放核酸序列。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二释放核酸序列连接所述第二扩增核酸序列到所述固体支持物。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二扩增核酸序列连接所述第二释放核酸序列到所述靶多核苷酸捕获序列。18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述第二释放核酸序列是限制性酶裂解序列。19.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述识别寡核苷酸包括裂解剂识别序列。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述裂解剂识别序列侧翼为简并核酸序列。2CN106460051A权利要求书2/4页21.根据权利要求20所述的方法，其中所述简并核酸序列与所述靶多核苷酸至少部分互补。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述裂解剂是限制性酶。23.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述接头核酸序列包括第一扩增核酸序列互补物。24.根据权利要求23所述的方法，所述方法包括在允许PCR扩增的条件下将所述第一扩增核酸序列互补物与所述第一扩增核酸序列杂交，从而扩增所述加标签的核酸序列。25.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述方法还包括在步骤(iv)