用于增强断裂型内含肽的稳定性和溶解度的方法和组合物.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115803335A(43)申请公布日2023.03.14(21)申请号202180042017.1(74)专利代理机构北京三友知识产权代理有限(22)申请日2021.04.30公司11127专利代理师李栋修褚瑶杨(30)优先权数据63/018,0842020.04.30US(51)Int.Cl.C07K14/195(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C07K17/08(2006.01)2022.12.12(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2021/0301612021.04.30(87)PCT国际申请的公布数据WO2021/222745EN2021.11.04(71)申请人俄亥俄州创新基金会地址美国俄亥俄州(72)发明人J·塔利斯D·W·伍德权利要求书3页说明书66页序列表11页附图17页(54)发明名称用于增强断裂型内含肽的稳定性和溶解度的方法和组合物(57)摘要本文公开了一种蛋白质纯化系统和制备这种系统的方法。具体而言，本发明涉及一种将N‑末端内含肽区段固定化于固体支持物上的方法，所述方法包括：在促进所述N‑末端内含肽和所述同源折叠配偶体之间的缔合的条件下，使N‑末端内含肽区段暴露于同源折叠配偶体；将所述N‑末端内含肽固定化于固体支持物上；使所述N‑末端内含肽经受破坏所述N‑末端内含肽和所述同源折叠配偶体之间缔合的条件；以及洗涤所述固体支持物以除去未结合的材料，从而将N‑末端内含肽区段固定化于固体支持物上。CN115803335ACN115803335A权利要求书1/3页1.一种在表达和纯化期间稳定N‑内含肽配体的方法，所述方法包括：a.通过N‑内含肽配体和同源结合配偶体的组装来形成内含肽复合物；b.纯化所述内含肽复合物；以及c.将所述内含肽复合物固定化于固体支持物上。2.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：d.使所述内含肽复合物经受破坏所述N‑内含肽配体和所述同源结合配偶体之间缔合的条件；以及e.提供允许所述N‑内含肽配体折叠成活性状态同时保持固定化的条件。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述同源结合配偶体包含C‑末端内含肽区段。4.如权利要求1‑3中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，所述N‑内含肽配体和所述同源结合配偶体在体内共表达。5.如权利要求4所述的方法，其中所述N‑内含肽配体和所述同源结合配偶体在来自单质粒或双质粒系统的单个细胞中表达。6.如权利要求1‑3中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，在所述N‑内含肽配体的表达后，将所述N‑内含肽配体反式暴露于所述同源结合配偶体。7.如权利要求1‑6中任一项所述的方法，其中，在步骤c)中，所述N‑末端内含肽区段被共价固定化于所述固体支持物上。8.如权利要求1‑7中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是常规色谱介质，所述色谱介质包括多孔树脂、膜、整料或磁珠。9.如权利要求8所述的方法，其中所述色谱介质是固体色谱树脂主链。10.如权利要求7‑9中任一项所述的方法，其中固体支持物上的N‑内含肽配体密度大于10mgN‑内含肽配体/mL树脂体积。11.如权利要求1‑10中任一项所述的方法，其中可以使用离液剂或者碱性或酸性溶液来产生破坏所述N‑内含肽配体和所述同源结合配偶体之间缔合的条件。12.如权利要求2所述的方法，其中破坏所述N‑内含肽配体和所述同源结合配偶体之间的缔合之后是导致所述N‑内含肽配体回复至活性状态的条件，其中所述N‑内含肽配体可以接纳新的结合配偶体。13.如权利要求12所述的方法，其中所述破坏条件包括以下中的一者：离液剂诸如盐酸胍，酸诸如磷酸，或碱诸如氢氧化钠。14.如权利要求1‑13中任一项所述的方法，其中所述N‑内含肽配体已经源自天然内含肽。15.如权利要求14所述的方法，其中N‑内含肽配体源自NpuDnaE内含肽。16.如权利要求14所述的方法，其中所述同源结合配偶体源自NpuDnaE内含肽。17.如权利要求1‑16中任一项所述的方法，其中所述N‑内含肽配体包含纯化标签和INTN区段。18.如权利要求17所述的方法，其中所述N‑内含肽配体不包含所述N‑内含肽配体的所述INTN部分内的任何半胱氨酸残基。19.如权利要求17或18所述的方法，其中包含天然存在的INTN区段的N‑内含肽配体已经被修饰，以使得至少一个内部半胱氨酸残基已经突变为至少一个丝氨酸残基。2CN115803335A权利要求书2/3页20.如权利要求17所述的方法，其中所述纯化标签包含一个或多个组氨酸残基。21.如权利要求1‑20中任一项所述的方法，其中所述N‑内含肽配体包含一个或多个构成固定化部分的氨基酸。22.如权利要求21所述的方法，其中所述氨基酸被编码为与所述INTN区段的所述C