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本发明公开了一种基于多层纳米粒子膜层间小间隙的表面增强拉曼光谱检测方法,其是将在液液界面自组装的单层纳米粒子膜重复固定在穿孔平板材料上形成多层纳米粒子膜,再将其盖于含有目标物分子的溶液上,利用多层纳米粒子膜层间形成1?6纳米的小间隙的毛细力作用,将目标物分子引入纳米粒子小间隙,然后在拉曼光谱仪下检测目标物信号。本发明通过构筑多层纳米粒子膜,利用纳米粒子膜层间内部形成的1?6纳米间隙,可实现表面增强拉曼光谱高灵敏、高稳定的检测。