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本发明提供了一种吗啉?茚酮?查尔酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用,其中吗啉?茚酮?查尔酮衍生物的化学结构式如下:;制备方法为:将5?羟基?1?茚酮、4?(4?吗啉)苯甲醛和氢氧化钠溶解于有机溶剂中回流搅拌反应,盐酸酸化至pH=6,处理后得中间体5?羟基?2?(4?吗啉苄基亚基)?2,3?二氢?1H?茚酮;将其与乙酸酐、三乙胺溶解于有机溶剂中;在室温下搅拌反应得吗啉?茚酮?查尔酮衍生物荧光探针。本发明的吗啉?茚酮?查尔酮衍生物荧光探针在95%水相(含5%二甲基亚砜,v/v)条件下能够选择性的与羧酸酯酶(CEs)作用,绿色荧光显著增强,特别是作为CEs荧光探针在细胞溶酶体荧光成像中的应用。