果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速测定吉林省地方标准.doc

吉林省质量技术监督局发布2023-07-02实行2023-07-02发布果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法MethodforrapiddetectionofAlicyclobacillusspp.injuiceproducts--Thereal-timePCRmethodDB22/T1162—2023DB22吉林省地方标准ICS67.050X04备案号：前言本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准重要起草单位：吉林省产品质量监督检查院。本标准重要起草人：史艳宇，刘俊会，华蕾，安伟，李媛媛，逄晓阳，王莹，王伟，李刚等。本标准系初次发布的地方标准。果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法范围本标准规定了果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的荧光PCR检查方法。本标准合用于果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测。规范性引用文献下列文献中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文献，其随后所有的修改单（不涉及勘误的内容）或修订版均不合用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文献的最新版本。凡是不注日期的引用文献，其最新版本合用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法。定义、术语和缩略语下列定义、术语和缩略语合用于本标准。3.1脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillusspp.脂环酸芽孢杆菌是一群耐热、嗜酸的杆状芽孢菌，革兰氏染色为阳性至可变，其在pH范围2.0~6.0，温度为45℃时生长良好。3.2缩略语3.2.1PCR：polymerasechainreaction，简称PCR。3.2.2DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。3.2.3dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。3.2.4dATP:deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸。3.2.5dCTP:deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸。3.2.6dGTP:deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。3.2.7dTTP:deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸。3.2.8dUTP:deoxyuridinetriphosphate，脱氧尿苷三磷酸。3.2.9UNG：uracilN-glycosylase，尿嘧啶N-糖基化酶。3.2.10Ttis:tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。3.2.11Ct值:每个反映管内的荧光信号达成设定的阈值时所经历的循环数。原理采用TaqMan方法，在比对脂环酸芽孢杆菌16SrRNA基因序列的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针。探针5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表达)，3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表达)，它在近距离内能吸取5’端荧光基团发出的荧光信号。PCR反映进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸取，仪器检测不到荧光信号；而反映进行到延伸阶段时，Taq酶的5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸取而被检测仪所接受。随着PCR反映的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现相应关系。试剂和材料除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为灭菌双蒸水。K液体培养基(见附录A)。引物5’-CGTAGTTCGGATTGCAGGC-3’5’-GTGTTGCCGACTCTCGTG-3’探针5’-FAM-CGGAATTGCTAGTAATCGC-TAMRA-3’5.4TaqDNA聚合酶。5.5dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。5.6DNA提取试剂：0.1%Chelex100水溶液。5.710×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（Ph8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.8脂环酸芽孢杆菌质控菌株：ATCC49025。6仪器和设备6.1荧光PCR仪。6.2离心机:20000rpm/min。6.3微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。6.4水浴锅。7检查程序24h-48h样品25mL(g)+K液体培养基225mL取1mL菌液进行细菌模板DNA提取荧光PCR检测结果报告47℃图1荧光PCR检测脂环酸芽孢杆菌程序图8环节8.1取样和增菌取样前消毒样品包装的启动处和取样工具。以无菌操作取样品25mL(g)，加在225mL的K液体培养基中，振摇使样品充足混合后，4