韭蛆内参基因筛选及关键解毒酶基因克隆与转录表达特性研究.doc

韭蛆内参基因筛选及关键解毒酶基因克隆与转录表达特性研究韭蛆是危害多种蔬菜的主要害虫,在我国多个省份均有报道,是蔬菜生产的大敌。韭蛆又称根蛆主要危害韭菜,因栖居在韭菜根部,防治极难。随着菜农对化学农药的滥用和过分依赖,韭蛆的选择压力,其对各种化学药剂的抗性逐渐增强,使得韭蛆的防治受到的艰巨的挑战。而分子生物学方面的研究尚未见报道,昆虫的解毒酶系在其抵抗外界环境胁迫起到极其重要的作用。对其解毒酶机制中的关键解毒酶基因对不同靶标农药的表达水平的了解,有助于在分子水平上,尤其是从生态友好的角度上对昆虫的防治提供一定的科学依据。本文以高通量IlluminaHiseq2000获得的韭蛆转录组为背景,对不同处理样本的韭蛆内参引物进行了系统的筛选,并对韭蛆ABC转运蛋白、细胞色素P450氧化酶系(CPY)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和非专一性酯酶(ESTs)关键解毒酶基因进行克隆,同时对其4种解毒酶基因在辛硫磷、毒死蜱、吡虫啉、氟嘧啶不同胁迫时间下的转录水平进行研究,具体结果如下:1.应用Real-TimePCR技术,在内参基因的筛选中对RPL10、EF1α、G6PDH、UBC、ACT、RPS3、TUB、GAPDH、EF2α等九个候选内参基因在23个不同处理样本进行了筛选。通过geNorm和Normfinder分析显示,在不同发育时期最适内参基因为ACT,最适双内参基因为ACT和EF2α;不同组织中最适内参基因为EF1α,最适双内参基因为EF1-α和ACT;不同性别中最适的内参基因为RPL10,EF1-α和RPL10;不同农药胁迫下最适内参基因为RPL10,双内参基因为RPL10和RPS3。2.对韭蛆4个解毒酶基因,ABC转运蛋白、细胞色素P450氧化酶系(CPY)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和非专一性酯酶(ESTs)进行了基因克隆,所获得核苷酸序列分别为1275、1733、609、801个碱基。系统发育分析结果表明:韭蛆CPY基因与同属双翅目家族的家蝇CYP基因同源性最近,同源性高达97%,比其他昆虫家族同源性更近;韭蛆GST基因与家蝇,黑果蝇同源性高达97%和96%,比其他昆虫家族同源性更近;韭蛆EST基因与双触目蚊科埃及伊蚊和白纹伊蚊同源性达到98%,亲缘关系比其他昆虫家族同源性更近;韭蛆ABC转运蛋白与冈比亚按蚊基因同源性为95%,亲缘性比其他昆虫家族同源性更近。3.应用Real-TimePCR技术分析韭蛆在不同农药不同处理时间4种基因的表达水平。得到如下结果:本试验发现在辛硫磷处理下谷胱甘-S-转移酶(GST)表达量变化不显著,而ABC转运蛋白及EST酶系表达量显著提高。预测韭蛆对辛硫磷的解毒作用中,谷胱甘-S-转移酶系不行使相应解毒功能,而起到主要作用的是ABC转运蛋白及酯酶(EST)酶系。在毒死蜱胁迫下,四种解毒酶随着时间基因表达量均显著提高,尤其是ABC转运蛋白基因表达的提高最显著,并且持续时间较长,说明在毒死蜱胁迫下ABC转运蛋白起到主要的解毒作用;在烟碱类农药(吡虫啉)胁迫下,随着时间除了谷胱甘肽-S-转移酶(GST)受影响较小以外,其他三种基因随着时间的变化,均呈现下调的趋势,低于对照组表达水平。在烟碱类农药(吡虫啉)胁迫下,ABC转运蛋白、EST、GST基因在第二天均呈现下调趋势,预测氟啶脲作用速度缓慢,还未影响到GST基因的表达水平。