深海热液口微生物—病毒互作及其次生代谢产物抗肿瘤转移活性的研究.doc

深海热液口微生物—病毒互作及其次生代谢产物抗肿瘤转移活性的研究深海热液口是地球上最极端的环境之一,具有黑暗、高压、低氧、缺乏营养以及富含多种矿物质等特点。自从上世纪70年代发现深海热液口存在独特的生物群落以来,深海热液口生态系统受到了海洋学家广泛的关注并成为了海洋生物学和生态学研究领域的热点之一。在深海热液口生态系统中,化能自养古菌和细菌利用热液口环境中的热能和化学能合成有机质,为热液口其他生物提供营养物质,构成了深海热液口生态系统的基础,对整个热液口生物群落结构具有调控作用。然而近年来的研究发现热液口病毒具有极高的丰度,病毒可能对微生物以及整个热液口生物群落结构都具有重要的调控作用。因此,研究深海热液口病毒与微生物的相互作用对了解热液口生态系统具有十分重要的意义。由于热液口环境中温度和化学梯度的动态变化,使得热液口微生物群落的多样性和丰度可能存在差异,因此我们首先对东太平洋中脊、南大西洋和西南印度洋海隆深海热液口硫化物、水体和底栖动物肠道样本中细菌的多样性进行分析。细菌16SrRNA基因序列分析结果表明,Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes在三大洋深海热液口中均为优势细菌门类,说明不同海区热液口细菌群落结构在优势菌群组成上存在一定程度的共性；但是,三大洋在细菌群落多样性和丰度方面具有很大的差异性。研究表明,热液口水体中细菌多样性要明显小于硫化物的细菌多样性,而动物肠道中的细菌多样性最小。结果显示,动物肠道细菌的绝大多数细菌门类都存在于硫化物细菌中,说明微生物是热液口底栖动物的主要食物来源,是深海热液口生态系统的初级生产者。通过对深海热液口细菌群落结构的研究,我们发现不同地区热液口细菌群落结构存在差异,而病毒与宿主菌之间的相互作用可能是造成这种差异的主要原因,因此我们对深海热液口病毒与宿主之间的互作进行了进一步研究。根据传统方法从环境样品中分离病毒需要的样品量较大,而目前的采样技术很难从深海热液口环境采集大量样品并提取到足够的病毒宏基因组DNA,因此对深海病毒的研究变得尤为困难。在本研究中,我们首先对热液口样品的病毒分离以及病毒宏基因组提取技术进行改进,利用PEG6000处理结合超高速离心的方法对病毒颗粒进行浓缩,再采用全基因组扩增方法对提取到的病毒宏基因组DNA进行扩增,提高病毒宏基因组DNA的浓度。通过透射电镜观察和荧光定量PCR检测内参病毒GVE2拷贝数等方法,结果表明采用改进后的病毒分离及病毒宏基因组提取和扩增的方法,病毒分离效率较好,病毒宏基因组DNA浓度可以满足宏基因组高通量测序的要求。利用改进后的方法,从西南印度洋深海热液口3个站点的沉积物样品中,分别获得了病毒和微生物宏基因组DNA,并进行了高通量测序分析。分析结果表明,热液口病毒功能基因和微生物功能基因的分类较为相似,其中与氨基酸运输与代谢、转录、无机盐运输与代谢、细胞膜和细胞壁代谢和能量生成与转化相关基因等与基因转录和生物大分子合成代谢相关基因所占比例较高。在病毒宏基因组中,发现一类与细胞膜和细胞壁代谢相关的功能基因,其中包含了与噬菌体裂解相关的糖基转移酶、二肽酶和N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶,表明在一定的条件下热液口病毒对微生物具有裂解作用。通过KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)代谢通路分析,结果发现病毒的功能基因不仅参与微生物的代谢过程,而且还存在一些病毒特有的功能基因(如葡糖激酶、6-磷酸果糖激酶1、羟酰谷胱甘肽水解酶、D-乳酸脱氢酶、乙酸激酶和乙醛脱氢酶等的编码基因)使得微生物的代谢通路更加完善,对微生物的代谢通路具有一定的补偿作用,从而增强了微生物对环境的适应性。本文的研究结果表明,深海热液口病毒能够对热液口微生物群落结构和代谢过程进行调控,进而影响整个热液口生态系统。通过对深海热液口微生物与病毒相互作用的研究发现,热液口病毒会影响宿主的代谢过程。微生物在受到病毒侵染的过程中会发生一系列代谢变化,这与肿瘤在发生和发展过程中发生代谢改变具有一定相似性,因此热液口病毒感染宿主菌产生的次生代谢产物可能具有抗肿瘤活性。由于深海热液口极端的生态环境以及热液口存在丰富的生物资源,使得热液口微生物次生代谢产物无论是在分子结构还是生物活性方面都具有独特性,可能成为抗肿瘤新药开发的重要来源。因此,在本实验室前期研究基础上,本论文利用热液口嗜热噬菌体GVE2感染其宿主菌Geobacillussp.E263产生的次生代谢产物,筛选具有抗肿瘤转移活性的化合物,并深入研究其抑制肿瘤细胞转移的机制。我们从本实验前期研究获得的24种差异代谢产物中选取了6种结构已知的化合物(L-正亮氨酸、邻氨基对甲苯酚、对羟基苯甲醇、色醇、腺嘌呤和安替比林),研究其对人胃癌和乳腺癌细胞及相应正常细胞增殖