豌豆离体再生体系的建立及遗传稳定性研究.doc

豌豆离体再生体系的建立及遗传稳定性研究豌豆(PisumsativumL.)属于豆科、豌豆属一年生或越年生草本植物,豌豆是一种兼有粮食、饲料、蔬菜、肥料和医药等多种用途的农作物。近年,豌豆在畜牧业和可持续农业发展中起着重要作用,种植面积和市场需求不断扩大,但由于病虫害以及干旱、低温等不利条件的影响,产量很不稳定。利用植物组织培养技术建立其再生体系及进行遗传稳定性研究,将为豌豆的离体快繁和遗传转化等工作奠定基础。本研究选用半无叶型豌豆品种‘陇豌1号’和蔓生型豌豆品种‘S3008’为实验材料,研究不同基因型、培养基激素配比对愈伤组织诱导、分化的影响,和通过染色体观察分析再生植株的遗传稳定性。结果如下:1.经过对不同外植体和培养条件的比较,认为豌豆茎段是豌豆组织培养的最佳外植体。诱导愈伤组织最适培养基是MS+2mg·L-1TDZ+0.2mg·L-12,4-D,‘陇豌1号’和‘S3008’茎段愈伤组织诱导率分别达到88.7%和86.7%。在只附加TDZ的情况下,外植体不能增殖或增殖缓慢,颜色逐渐变浅发黄。较低浓度的2,4-D能显著提高愈伤组织诱导率,若2,4-D浓度过高,愈伤组织生长旺盛,后期愈伤组织褐化,表面出现大量白色颗粒状突起,不利于不定芽的分化。2.诱导不定芽形成的最适培养基为MS+2mg·L-1TDZ+1mg·L-16-BA,‘陇豌1号’和‘S3008’茎段愈伤组织分化率分别达到76.7%和74.7%;每个愈伤组织平均含有不定芽分别为4.2和4.4个。TDZ和6-BA组合对豌豆不定芽的诱导有一定的促进作用,在激素浓度相同的情况下,无论不定芽的再生频率还是数量,TDZ均优于6-BA。3.经过对不同抗氧化剂和吸附剂抑制愈伤组织褐化的研究,筛选出在MS+1.5mg·L-16-BA+0.2mg·L-12,4-D培养基中添加0.05g·L-1核黄素对抑制愈伤组织褐化效果最佳,两个豌豆品种愈伤组织褐化率降低到18.0%和20.7%,愈伤组织长势较好且生长快。培养基中加入0.5g·L-1VC时,愈伤组织褐化率分别为28.7%和34.0%,显著低于附加0.1和0.3g·L-1VC。培养基中添加0.5g·L-1AC愈伤组织褐化率为51.3%和50.7%,当AC含量为1.5g·L-1褐化率降低到34.0%和35.3%,但愈伤组织长势较弱。4.不定芽继代培养最佳培养基是MB5+1mg·L-16-BA+1mg·L-1IAA,GA3的添加与否得到了两种形态的不定芽。添加GA3的培养基中不定芽颜色较浅且细长,没有添加GA3的培养基中不定芽颜色较深且短粗。5.经过对影响茎段外植体直接诱导不定芽的研究,筛选出较适合2个豌豆品种的茎段直接诱导不定芽的培养基为MS+4mg·L-1TDZ+0.3mg·L-1IAA。‘陇豌1号’和‘S3008’,诱导率可以达到78.7%和80.0%,平均含有不定芽数达到3以上。6.最适生根培养基为蔗糖浓度20g·L-1的1/2MS+1.5mg·L-1ABT,不定芽的生根率达到了74%以上,平均每个不定芽生根4.2条。7.通过染色体分析,两个豌豆品种的再生植株和供体亲本植株根尖染色体数目相同(2n=2x=14),再生植株倍性稳定和供体亲本材料的染色体数一致,这初步表明再生植株遗传稳定。