丙泊酚对肝细胞肝癌生长和转移的抑制作用及机制研究.doc

丙泊酚对肝细胞肝癌生长和转移的抑制作用及机制研究第一部分丙泊酚抑制肝癌细胞生长和转移的体外研究研究背景：丙泊酚是一种常用于肿瘤切除手术的静脉麻醉药,近年丙泊酚对肿瘤细胞生长和转移的抑制作用及对肿瘤免疫的影响逐渐受到关注。丙泊酚体外可以直接抑制人宫颈癌、纤维肉瘤、骨肉瘤等细胞系的侵袭能力首先被报道,随后,体内和体外实验均证明丙泊酚能抑制乳腺癌细胞系的生长和转移,关于食道癌、肺癌等离体细胞研究也证实了丙泊酚的抗癌作用。但是,丙泊酚对肝癌细胞的具体作用目前国内外尚无报道。研究目的：本研究的目的是明确丙泊酚对肝癌细胞的生长和侵袭能力的具体作用及初步机制。研究方法：1.不同浓度的丙泊酚与肝癌HepG2细胞、正常肝L-02细胞共培养。2.MTT法测定肝癌HepG2细胞、正常肝L-02细胞的细胞活性。3.酶联免疫吸附测定法检测Caspase8、Caspase9活性表达。4.Transwell小室进行细胞侵袭试验。5.明胶酶谱分析基质属蛋白酶-9的活性。6.westernblot测定MMP-9蛋白表达。研究结果1.丙泊酚抑制肝癌细胞HepG2(A)和正常肝细胞L02(B)的生长。其中,正常细胞表现出更强的丙泊酚抗性。2.丙泊酚诱导肝癌细胞HepG2产生细胞凋亡,并伴随Caspase-8和Caspase-9活性的显著增强。而且,HepG2细胞凋亡率的增加与丙泊酚作用浓度呈正相关趋势。3.5ug/ml和10ug/m丙泊酚与HepG2细胞共培养后均能显著降低HepG2细胞的附着力。4.分别用5、10μg/ml的丙泊酚处理HepG2细胞16小时,MMP-9的活性呈剂量依赖性地降低,在HepG2细胞中的MMP-9的蛋白表达水平明显降低。结论：临床相关浓度的丙泊酚能够浓度依赖诱导肝癌细胞HepG2凋亡,可能与激活凋亡蛋白Caspase-8和Caspase-9有关。丙泊酚也能抑制HepG2的侵袭能力,明显抑制HepG2细胞MMP-9的活性。丙泊酚对肿瘤细胞的作用是多方面的,所以详细的机制还需要进一步的研究。第二部分丙泊酚通过上调巨噬细胞及微泡中miR-142-3p发挥抗肝癌作用的研究研究背景：本研究第一部分发现丙泊酚能够对离体肝癌细胞的生长和转移发挥抑制作用,但是这对指导临床还远远不够,我们进一步研究其作用机制,研究丙泊酚抑制肝癌细胞生长和转移的动物实验,特别是丙泊酚对机体免疫功能的影响。巨噬细胞具有异质性和多样性,在不同微环境信号刺激下,能分化成为生物学功能相反的亚群。肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤免疫微环境中最丰富的免疫细胞,受到肿瘤细胞的募集与其他基质细胞一起共同构成肿瘤免疫微环境。肝癌患者体内巨噬细胞集落刺激因子水平升高可预测肝癌术后转移和复发情况。对多种肿瘤的研究表明,miRNA在肿瘤致病过程中起着重要的调节作用,miR-142-3p在抑制肝癌细胞迁移和侵袭中起着重要的作用,而增强miR-142-3p的表达可以抑制肿瘤相关巨噬细胞的分化,发挥抗肿瘤作用。微泡中负载包括miRNA在内的多中生物活性分子,共同组成“信号复合体”。巨噬细胞受到诱导后释放富含信息的微泡,通过释放到胞外环境的这些微泡,将信息物质传递给周围及远处的肿瘤细胞发挥相应的作用。已有研究证明丙泊酚可以减少巨噬细胞释放的活性氧家族,发挥抗脑胶质瘤的作用,本部分研究假设丙泊酚能够活化肿瘤相关巨噬细胞,上调miR-142-3p表达并刺激肿瘤相关巨噬细胞分泌富含miR-142-3p的微泡,通过微泡发挥抑制肝癌细胞生长和侵袭的能力。研究目的：本研究假设丙泊酚能够活化肿瘤相关巨噬细胞,上调miR-142-3p的表达,并刺激肿瘤相关巨噬细胞分泌微泡,微泡运送miR-142-3p到肝癌细胞,从而抑制肝癌细胞的生长和转移。实验方法：1.建立肝癌细胞系Hepa1-6小鼠皮下移植瘤模型；差速离心分离血浆中MVs,根据处理药物的不同对荷瘤小鼠分组,共分8组：(1)20mg/kg丙泊酚；(2)100μg/kgclodrolip;(3)20mg/kg丙泊酚+100μg/kgclodrolip;(4)50mg/kg丙泊酚；(5)50mg/kg丙泊酚+100μg/kgclodrolip;(6)20μgMVs;(7)miR-142-3p抑制剂；(8)20mg/kg丙泊酚+miR-142-3p抑制剂。荷瘤小鼠处死后测量肿瘤体积和重量。2.分离荷瘤小鼠TAMs并与肝癌Hepal-6细胞共培养,(?)ranswell小室进行细胞侵袭试验。3.实时荧光定量PCR测定各组提取的巨噬细胞、微泡及肝癌Hepa1-6细胞内的miR-142-3p含量,使用LipofectamineTM2000转染miR-142-3p抑制剂给肝癌细胞荷瘤小鼠或巨噬细胞后测定miR-142-3p含量。结果：1.丙泊酚抑制肝细胞癌荷瘤小鼠肿瘤的生长。2.丙泊酚处