丙泊酚通过上调miR-219-5p抑制肝癌生长和转移的作用与机制研究.doc

丙泊酚通过上调miR-219-5p抑制肝癌生长和转移的作用与机制研究研究背景原发性癌是常见的恶性肿瘤,手术切除是目前治疗肝癌最常用和最有效的方法,然而即使是根治性手术切除的患者,5年的复发率仍高达70%。围术期是癌细胞转移的关键时间窗,丙泊酚作为肿瘤切除手术常用的静脉麻醉药,研究显示其具有抑制肿瘤生长和转移的作用。丙泊酚抑制肝癌的具体作用及机制目前国内外尚无明确报道。mniRNAs在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用,通过前期实验发现,丙泊酚可显著上调miR-219-5p表达,miR-219-5p在多种肿瘤中均具有抑癌作用。因此我们探究丙泊酚是否通过上调miR-219-5p的表达抑制肝癌的生长与转移,并就具体作用机制作进一步探讨。研究目标1.验证丙泊酚通过上调miR-219-5p的表达抑制肝癌细胞增殖与侵袭转移。2.探讨丙泊酚上调miR-219-5p抑制肝癌侵袭转移与EMT进程的作用机制,初步探讨miR-219-5p的作用靶基因RAB18。3.揭示RAB18在人肝癌细胞系、肝癌组织及其匹配癌旁肝组织中的表达水平,及其在肝癌患者预后评估的价值;探讨肝癌发生发展过程中RAB18的功能及调控机制,以寻求肝癌侵袭转移新的理论依据。研究内容与方法1.揭示丙泊酚通过上调miR-219-5p的表达抑制肝癌的增殖和侵袭转移。(1)体外实验验证丙泊酚对肝癌细胞增殖和转移的影响;明确丙泊酚上调miR-219-5p的表达。(2)体外实验和体内裸鼠皮下成瘤及肝肺转移模型验证丙泊酚通过上调miR-219-5p抑制肝癌生长和转移的能力。2.阐明丙泊酚上调miR-219-5p抑制Wnt/p-catenin信号通路的激活和EMT进程,miR-219-5p靶向作用于RAB18。(1)RT-qPCR、westemnblot和免疫组化检测肝癌细胞和皮下成瘤组织中EMT蛋白和Wnt/p-catenin通路相关蛋白的表达;阐明丙泊酚上调miR-219-5p抑制肝癌的具体机制。(2)预测miR-219-5p靶基因RAB18序列,检测过表达miR-219-5p细胞中RAB18蛋白和mRNA水平,双荧光素酶报告实验明确miR-219-5p靶向于RAB18。3.揭示RAB18促进肝癌生长和转移的功能及其作用机制。(1)RAB18在肝癌组织中的表达特性及对肝癌患者预后相关性分析,免疫组化检测RAB18在肝癌组织和癌旁肝组织的表达。(2)RT-qPCR和westernblot检测RAB18在不同肝癌细胞株的表达。(3)建立稳定沉默RAB18的细胞株,体外实验和裸鼠皮下成瘤及肺转移模型验证RAB18对肝癌生长和转移的影响。(4)RT-qPCR和westernblot检测细胞周期蛋白和EMT蛋白的表达,明确RAB18促进肝癌生长和转移的作用机制。结果1.丙泊酚通过上调miR-219-5p的表达抑制肝癌的增殖和侵袭转移。2.丙泊酚上调miR-219-5p抑制Wnt/p-catenin信号通路和EMT进程,miR-219-5p靶向抑制RAB18。3.RAB18在肝癌组织中高表达,是肝癌患者不良预后的独立相关因素。RAB18通过调控细胞周期和EMT进程促进肝癌的生长和转移。结论丙泊酚抑制肝癌的生长和转移,是通过上调miR-219-5p的表达,抑制Wnt/p-catenin信号通路和细胞EMT进程,miR-219-5p直接靶向抑制RAB18。本研究首次明确RAB18能促进肝癌的发生和发展进程,是肝癌患者不良预后的独立相关因素,有望成为肿瘤研究和治疗的新靶点。