虫草益肾颗粒对高糖培养下人肾小球系膜细胞增殖及氧化应激的影响.doc

虫草益肾颗粒对高糖培养下人肾小球系膜细胞增殖及氧化应激的影响目的:观察虫草益肾颗粒对高糖培养下人肾小球系膜细胞(Humanmesangialcells,HMCs)增殖和氧化应激的影响,探讨虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞的作用机制。方法:依据血清药理学,制备虫草益肾颗粒和福辛普利的含药血清,然后进行药物血清干预HMCs的研究。体外培养HMCs,随机分为正常组、高糖组、福辛普利组及虫草益肾颗粒低、中、高剂量组6组。培养24h、48h、72h后收集细胞和细胞上清液。采用CCK-8法检测24h、48h、72h时HMCs增殖情况;采用流式细胞术检测48h、72h时细胞内活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平;采用比色法检测48h、72h时HMCs上清液中超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-PX)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的变化;Real-timePCR检测48h、72h时NADPH氧化酶亚型p22phox和p47phox的mRNA表达;WesternBlot检测48h、72h时p22phox和p47phox的蛋白表达情况。结果:1.CCK-8法检测细胞增殖情况:与正常组比较,高糖(30mmol/L)条件下,HMCs在24h、48h、72h三个时间点均有细胞增殖的效应,差异有统计学意义(P<0.01)。48h和72h时,与高糖组比较,福辛普利组与虫草益肾颗粒低、中、高剂量组均出现了对HMCs增殖的抑制作用,且差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2.各组HMCsROS表达情况比较:流式细胞术检测结果显示,同时间,与正常组比较,高糖组的HMCs内ROS生成量明显增多(P<0.05);与高糖组比较,经药物干预后的福辛普利组、虫草低、中、高剂量组细胞内ROS生成量明显减少,且差异有统计学意义(P<0.01),提示各治疗组均有疗效。3.各组细胞上清液中的SOD、GSH-PX、CAT活力和MDA含量的变化:同时间比较,高糖刺激后SOD、GSH-PX、CAT活力显著下降,MDA含量明显升高(P<0.01或P<0.05),经福辛普利和虫草益肾颗粒含药血清干预后,同时间,与高糖组比较,SOD、GSH-PX、CAT活力不同程度升高,MDA含量下降(P<0.01或P<0.05)。4.各组人肾小球系膜细胞p22phox和p47phoxmRNA表达情况比较:同时间,与正常组比较,高糖组p22phox和p47phoxmRNA表达水平明显升高(P<0.01);同时间,与高糖组比较,各治疗组均可不同程度地下调p22phox和p47phoxmRNA表达(P<0.01)。5.各组人肾小球系膜细胞p22phox和p47phox蛋白表达量的比较:正常组HMCs中可低水平地表达p22phox和p47phox蛋白,与同时间点的正常组比较,高糖组中的p22phox和p47phox蛋白表达量明显增多(P<0.01);同时间,与高糖组比较,各治疗组的p22phox和p47phox的蛋白表达量均下调(P<0.01)。结论:1.高糖刺激下,可促进HMCs的增殖,使活性氧簇ROS生成增多,降低SOD、GSH-PX、CAT活力、提高MDA含量,上调p22phox和p47phoxmRNA及蛋白表达水平,从而加剧氧化应激反应。2.虫草益肾颗粒对高糖培养下HMCs的增殖有抑制作用。3.虫草益肾颗粒可能通过降低活性氧簇ROS的生成、提高酶抗氧化系统中SOD、GSH-PX、CAT活力、降低MDA的含量、下调p22phox和p47phoxmRNA及蛋白表达水平等途径来干预肾小球系膜细胞的氧化应激反应。4.抑制HMCs的增殖和氧化应激反应可能是虫草益肾颗粒防治DKD,保护肾脏,延缓疾病进展的作用机制之一,同时该中药复方的治疗作用具有一定时间和剂量效应依赖性。