虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞megsin及p38MAPK信号通路影响的研究.doc

虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞megsin及p38MAPK信号通路影响的研究目的：基于三焦气化理论益肾泄浊法拟虫草益肾方制成虫草益肾颗粒并观察其对高糖培养下人肾小球系膜细胞(humanglomerularmesangialcell,HMC)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpinB7(megsin)及丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinasessignalpathway,p38MAPK)信号通路的影响,探讨虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞保护作用的机制。方法：将50只雄性wistar大鼠随机分为正常组、虫草益肾颗粒高、中、低剂量组及福辛普利组5组,每组10只,每组大鼠灌胃给药：虫草益肾颗粒高、中、低剂量组中药溶液0.972g/(kg·d).0.486g/(kg·d).0.243g/(kg·d)(含颗粒量),福辛普利0.9mg/(kg·d)水溶液,正常组等体积生理盐水,连续给药7天后根据血清药理学方法制备动物含药血清。将常规培养的HMC分为6组并给与相应处理：正常组(10%正常大鼠血清+RPMI-1640培养液)、高糖组(10%正常大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培养液)、虫草益肾颗粒高剂量组(10%虫草益肾颗粒高剂量组大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培养液)、虫草益肾颗粒中剂量组(10%虫草益肾颗粒中剂量组大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培养液)、虫草益肾颗粒低剂量组(10%虫草益肾颗粒低剂量组大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培养液)、福辛普利组(10%福辛普利组大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培养液),MTT法检测24h、48h及72h细胞增殖情况,根据细胞增殖的差异性选取48h、72h两个时间点进行后续实验。于相应因素干预作用后的48h、72h,采用免疫细胞化学法检测各组细胞中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK(磷酸化丝裂原活化蛋白激酶)蛋白表达与分布,real-timePCR法检测serpinB7mRNA.p38MAPKmRNA基因转录,采用westernblot法检测megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达。结果：(1)MTT结果显示：与正常培养环境相比,高糖(30mmol/LD-葡萄糖)环境可刺激HMC增殖(P<0.05,P<0.01)；24h、48h、72h时,与高糖组相比,虫草益肾颗粒组及福辛普利组大鼠含药血清对HMC增殖均有抑制作用(P<0.05,P<0.01)；虫草益肾颗粒高剂量组抑制效果优于福辛普利组(P<0.05)；(2)免疫细胞化学结果显示：megsin与p38MAPK蛋白主要在HMC胞浆中表达,p-p38MAPK蛋白在HMC胞核与胞浆中均有表达48h、72h时,与正常组相比,高糖组HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达均增加(P<0.01),与高糖组相比,虫草益肾颗粒组与福辛普利组HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),且以虫草益肾颗粒高剂量组降低效果明显；(3)Real-timePCR结果显示：在正常环境培养下,HMC中即有serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的转录48h、72h时,与正常组较比,高糖组HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的转录明显增加(P<0.01),与高糖组相比,虫草益肾颗粒组及福辛普利组HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的转录降低(P<0.05,P<0.01),且以虫草益肾颗粒高剂量组降低效果明显；72h时,虫草益肾颗粒高、中剂量组下调HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的转录作用优于福辛普利组(P<0.05)；(4)Westernblot结果显示：在正常环境培养下,HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白均有表达48h、72h时,与正常组相比,高糖组HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达明显升高(P<0.01)；与高糖组相比,虫草益肾颗粒组及福辛普利组HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),且以虫草益肾颗粒高剂量组降低效果最明显(P<0.01)；观察含药血清对降低HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达作用方面,48h时,虫草益肾颗粒高剂量组优于福辛普利组(P<0.05),72h时,虫草益肾