蜂胶和硫酸化多糖的增强免疫和抗病毒活性研究.doc

蜂胶和硫酸化多糖的增强免疫和抗病毒活性研究畜禽传染病一直是危害畜牧业发展的首要问题,尤其是病毒性传染病,迄今尚无有效的治疗方法。采用疫苗接种进行预防仍是最重要的措施,应用免疫佐剂能够提高疫苗的免疫效果。但是目前国内外广泛使用的油乳类和铝胶等化学性免疫增强剂常有局部刺激强、致癌、致畸等副作用。因此,研制高效、低毒的新型免疫增强剂成为亟待解决的问题。蜂胶是一种含有黄酮类、芳香酸类、酚类、氨基酸等多种成分的天然活性物质,具有增强免疫、抗病毒、抗菌和抗氧化等生物活性；硫酸化多糖是一类天然多糖经硫酸化修饰后糖羟基上带有硫酸根的多糖,比天然多糖具有更多、更强的生物活性。本研究选择蜂胶和硫酸化多糖为研究对象,分别研究了蜂胶对猪细小病毒灭活苗和硫酸化多糖复方对鸡新城疫疫苗的增强免疫作用和抗病毒活性。试验分为以下六个部分：试验Ⅰ、蜂胶对猪细小病毒灭活疫苗佐剂作用的研究为了研究蜂胶对猪细小病毒灭活疫苗的佐剂作用,首先制备蜂胶、铝胶和油佐剂3种佐剂猪细小病毒(PPV)灭活疫苗,并检测其安全性。然后比较3种佐剂疫苗对效检动物豚鼠和家兔的免疫效果。免疫应答试验,分别用豚鼠68只和家兔40只随机均分为4组,1-3组分别免疫3种佐剂的PPV疫苗,空白对照组注射等量生理盐水。于免疫后8周内每周分别采血测定血清PPV特异性抗体、豚鼠脾脏和家兔外周血淋巴细胞的增殖和IL-2、IL-4的分泌。免疫保护试验,50只豚鼠随机均分为5组,3个佐剂组分别免疫3种佐剂的PPV疫苗,攻毒对照组和空白对照组注射等量生理盐水。于免疫后第42d除空白对照组外用PPV强毒攻毒,攻毒后不同时间点采血测定血清PPV特异性抗体、外周血淋巴细胞的增殖及IL-2和IL-4的分泌,攻毒后28d采集心、肝、脾、肺、肾和性腺用实时荧光定量PCR测定PPV含量。结果显示,蜂胶的安全性高于油佐剂和铝胶佐剂；3种佐剂均能提高豚鼠和家兔对PPV疫苗的免疫应答,蜂胶提高血清抗体的效果优于铝胶佐剂、弱于油佐剂,促进淋巴细胞增殖及IL-2和IL-4分泌的效果优于油佐剂和铝胶佐剂；攻毒后,蜂胶提高抗体生成的作用强于铝胶佐剂,促进淋巴细胞增殖和细胞因子分泌和降低器官中PPV的含量的作用最为显著。结果表明,蜂胶对PPV疫苗具有较强的佐剂活性,是一种安全有效的佐剂。试验Ⅱ、蜂胶对猪细小病毒灭活疫苗免疫效果的影响为了研究蜂胶的佐剂活性,比较了蜂胶、铝胶和油佐剂3种佐剂的猪细小病毒灭活疫苗对猪的免疫效果。25～30日龄仔猪20头随机均分为4组,1-3组分别颈部肌肉注射2mL蜂胶、铝胶和油佐剂猪细小病毒灭活疫苗,空白对照组注射等量生理盐水。分别于免疫后第7(D7)、D14、D21、D28、D35和D49耳静脉采血,用p-微量法检测血清中猪细小病毒特异性抗体,于D7、D14、D21、D35颈静脉采血,用ELISA方法测定血清中IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的含量,于D7、D14、D35颈静脉采血,用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖,同时用ELISA方法检测淋巴细胞上清液中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量。结果显示,蜂胶佐剂组在D7、D14的抗体效价均高于铝胶佐剂组(P<0.05)和油佐剂组(P>0.05),其余时间点均高于或显著高于铝胶佐剂组；在D7～D35,蜂胶佐剂组的IgM、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的含量均高于或显著高于铝胶佐剂组和油佐剂组,IgG1含量显著高于铝胶佐剂(P<0.05)；在D7～D35,蜂胶佐剂组的淋巴细胞增殖显著高于铝胶佐剂和油佐剂组(P<0.05),IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量多显著高于铝胶佐剂和油佐剂组(P<0.05)。这些结果表明,蜂胶能显著提高猪细小病毒灭活疫苗的免疫效果,尤其在增强细胞免疫方面优于油佐剂和铝胶佐剂。试验Ⅲ、蜂胶体外抗PPV的研究为了研究蜂胶的抗病毒作用,测定了蜂胶体外对猪细小病毒感染细胞能力的影响。首先将蜂胶自2000μg·mL-1连续2倍比稀释成10个浓度,加到长成单层的猪肾细胞(PK-15)株的培养体系中,用MTT法测定其对PK-15的安全浓度；然后取PPV和安全浓度范围内5个浓度的蜂胶,以3种加药方式(先加蜂胶后接种病毒、先接种病毒后加蜂胶、蜂胶与病毒混合感作后)加入到PK-15的培养体系中,同法测定PPV感染PK-15能力(细胞A570值)的变化,并用实时荧光定量PCR方法检测PK-15中PPV的含量。结果显示,在3种加药方式中,蜂胶在31.2-250μg.mL-1范围内的细胞A570值均显著高于病毒对照组(P<0.05),细胞中的PPV含量均显著低于病毒对照组(P<0.05),表明蜂胶可以增强PK-15细胞抵抗和清除PPV感染；这种作用与