菠萝种质玻璃化法超低温保存研究.doc

菠萝种质玻璃化法超低温保存研究菠萝（Ananascomosus）是一种重要的热带亚热带草本果树。本研究以四个菠萝品种：澳大利亚卡因（无刺卡因类）、夏威夷（无刺卡因类）、巴厘（皇后类）、台农16号（杂交种）为试验材料，以茎尖作为外植体，对玻璃化法超低温保存及保存过程中细胞的超微结构变化进行了研究。主要研究结果如下：1．建立了菠萝茎尖玻璃化法超低温保存体系。其保存方法为：2.0～3.0cm的茎尖，在含有0.5mol／L蔗糖的培养基上预培养1～2d，然后剥取1.0～2.5mm的茎尖，先在室温下用LS装载液（MS+甘油2.0mol／L+蔗糖0.4mol／L）预处理50min，再用PVS₂溶液于0℃下处理40min，换一次PVS₂溶液后迅速投入液氮，保存至少1h后，在40℃水浴中化冻90s，用1.2mol／L的蔗糖培养液洗涤2次，每次10min，然后转入含0.3mol／L蔗糖的MS培养基上，暗培养48h后转入MS+BA0.5mg／L的恢复培养基上，暗培养1周后转移到正常光下，最高可获得96.2％的成活率和93.3％的再生率。保存后的菠萝无菌小苗在形态上与对照一致，生根后可移栽成活。2．比较了不同菠萝品种间茎尖超低温保存效果的差异。不同品种间超低温保存效果差异显著，四个品种：澳大利亚卡因（无刺卡因类）、夏威夷（无刺卡因类）、巴厘（皇后类）、台农16号（杂交种）的成活率分别为：96.5％、95.3％、78.6％、87.7％，再生率分别为：93.2％、92.6％、76.7％、87.7％。3．对超低温保存后茎尖的恢复培养基进行了筛选。超低温保存后的菠萝茎尖在MS+BA0.5mg／L+蔗糖30g／L+琼脂6.8g／L的培养基上恢复生长最好，茎尖成活率和再生率最高，分别为95.6％和93.0％，且茎尖恢复生长较快，叶片肉质较厚，叶色浓绿有光泽。4．应用透射电子显微镜对菠萝茎尖超低温保存过程中细胞的超微结构变化进行观察分析。结果表明，茎尖在诱导脱水过程中，细胞的质壁分离程度逐渐加重；经过冷冻和解冻环节后，部分细胞的细胞壁、膜系统损伤严重，但大部分生长点中心分生组织细胞结构变化轻微，是可逆变化，在恢复培养时能够得到修复，并再生出植株。