香石竹种质资源小滴玻璃化法超低温保存技术研究.doc

香石竹种质资源小滴玻璃化法超低温保存技术研究香石竹(DianthuscaryophyllusL.)是闻名世界的四大切花之一,因其花形秀美,花色艳丽,而被广泛应用于花卉领域。超低温保存可以对香石竹种质资源进行长期保存,具有省时省力,不受自然环境及病虫害的影响,遗传稳定性高的优点,是今后种质资源保存的重要手段。本文以香石竹品种’Master’为实验材料,利用正交设计和单因素方差分析优化了香石竹茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系,并将该体系应用到三个香石竹品种’Calibra’、’Lamour’、(?)’Ofcar’中,最后对保存过程中细胞超微结构的变化进行了观察。主要研究结果如下：建立了香石竹品种’Master’茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系。具体保存方法为：取继代1.5-2个月的香石竹试管苗’Master’,剥取含2-4片叶原基的无菌茎尖(1-2mm)于室温下分别经含0.3M蔗糖的MS液体培养基预培养2d,5%DMSO+5%甘油预培养10min,2M甘油+0.4M蔗糖装载20min,0℃下用冰冻保护剂PVS2处理60min,冻存后的材料室温下迅速投入MS+1.2M蔗糖的卸载液中洗涤2次,每次10min。然后转入恢复培养基暗培养1周后转到正常光照下培养,存活率和成苗率分别为91%和73%。运用优化的方案对’Calibra’、’Lamour’、和’Ofcar’3个香石竹品种进行超低温保存,平均成活率分别为85%,50%和47%；平均成苗率分别为62%,42%,42%。结果显示品种间差异显著。利用透射电镜观察冻存过程中细胞超微结构的变化,结果表明,茎尖分生组织细胞变化最大的是在脱水阶段,在脱水阶段发生的主要变化是部分原生质体收缩,细胞质浓厚,质壁分离极其严重,大液泡变小,内质网膨大,质膜内陷形成一系列小泡,这些小泡从膜上脱落下来,使细胞内小泡大量增加,核周隙扩张,线粒体膨胀变形,线粒体基质较对照细胞稀薄,脊更加发达,受到破坏的细胞器或膜系统流到质壁分离的空腔内。冷冻24小时细胞质壁分离更加严重有些细胞内部空洞化,在某些细胞壁周围出现嗜饿颗粒,标志着细胞受到致死损伤,经过恢复培养,多数细胞损伤得以修复,转化为与对照相似的细胞结构。