胆碱能抗炎通路调节肺泡巨噬细胞极化减轻急性肺损伤的机制研究.doc

胆碱能抗炎通路调节肺泡巨噬细胞极化减轻急性肺损伤的机制研究背景与目的:急性肺损伤(ALI)为脓毒症的常见并发症,发病率和死亡率居高不下。肺泡巨噬细胞(AM)在ALI的防御和修复中起着重要的作用。在不同微环境刺激下,巨噬细胞可发生M1和M2极化,但AM的极化及对ALI的影响尚不明确。GTS-21为胆碱能抗炎通路(CAP)选择性α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂(α7nAChR),在ALI的治疗中具有广阔的应用前景。然而,GTS-21介导的抑制炎症反应的分子机制仍有部分不清楚。高迁移率族蛋白-1(HMGB1)可激活黑素瘤缺乏因子2(AIM2)炎症小体复合物引起促炎反应,且两者在ALI中均具有重要的作用。然而HMGB1与AIM2之间的相互作用机制尚不清楚。巨噬细胞可表达AIM2炎症小体复合物和HMGB1的主要受体:晚期糖基化终产物受体(RAGE)、Toll样受体2、4(TLR2、TLR4)来传递细胞内信号。研究目的:1.探索GTS-21通过调节AM的极化功能来参与脂多糖(LPS)所致ALI的抗炎机制;2.探索HMGB1通过调节AM的极化功能来参与LPS所致ALI的炎症反应机制。方法:第一部分:从C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(BALF)中提取AM,刺激后极化为M1型AM和M2型AM。再将M1和M2型AM分别注入去除AM的小鼠气道,然后建立LPS所致ALI模型,观察M1和M2型AM对LPS所致ALI小鼠肺损伤评分、肺水肿程度和肺部炎症因子的影响。第二部分:建立LPS所致ALI小鼠模型,分为空白对照组、LPS组、GTS-21组和GTS-21+LPS组。体外培养AM,在有无LPS和有无GTS-21的刺激下,分为同样四组。通过体内和体外实验观察GTS-21对LPS所致ALI中AM的数量、AM的极化以及对HMGB1分泌的影响。第三部分:应用anti-HMGB1或rHMGB1干预LPS所致ALI小鼠,测定干预措施对肺组织炎症损伤、AIM2炎症小体复合物的蛋白以及mRNA表达。通过流式细胞学检测M1型AM表面相关因子(MHCⅡ、CD80、CD86、CD40)和M2型AM表面相关因子(CD206、IL-10)的表达水平。体外培养骨髓来源的巨噬细胞,观察Anti-HMGB1或rHMGB1刺激后AIM2炎症小体复合物的蛋白以及mRNA表达以及M1和M2型AM表面相关因子的表达。第四部分:为了验证HMGB1对巨噬细胞的作用通路,应用anti-HMGB1或rHMGB1作用于LPS所致ALI小鼠,观察TLR2/4、RAGE受体和NF-κB表达水平的变化;应用TLR2/4和RAGE受体拮抗剂作用于LPS所致ALI小鼠,观察肺部炎症和AIM2炎症小体复合物的变化。在体外培养的巨噬细胞中加入以上干预措施,观察AIM2炎症小体复合物的变化。结果:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI的促炎反应。主要表现为:肺MPO活性增强,肺W/D上升,BALF中(TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1)的水平明显增高。M2型AM可减轻LPS所致ALI小鼠的炎症反应,主要表现为肺损伤评分降低,肺MPO活性和肺W/D减低,BALF中MCP-1的水平降低。(2)在LPS所致ALI小鼠中,GTS-21可减轻肺组织炎症,减少AM的数量及炎症因子的表达,降低肺组织、血浆以及BALF中HMGB1的分泌和表达。GTS-21可降低LPS所致ALI小鼠和体外培养的AM中M1型AM生物活性分子iNOS和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-12)的水平,增加M2型AM生物活性分子Arg1、Ym1和抗炎因子(CCL17、CCL22、CCL24)的水平。(3)抗HMGB1抗体可减轻LPS所致ALI小鼠肺组织炎症,抑制AIM2炎症小体复合物的活性,抑制AM向M1极化;rHMGB1可增加LPS所致ALI小鼠肺组织炎症,增强AIM2炎症小体复合物的活性,促进AM向M1极化。(4)抗HMGB1抗体可下调LPS所致ALI中TLR2、TLR4和RAGE/NF-κB的表达;rHMGB1可上调上述受体的表达;(TLR2、TLR4受体拮抗剂)LPS-RS和(RAGE受体拮抗剂)FPS-ZM1能抑制LPS所致ALI肺部炎症,降低AIM2炎症小体复合物的表达。结论:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI肺组织炎症;M2型AM可减轻LPS所致ALI肺组织炎症。(2)胆碱能抗炎通路可通过减少AM的数量,抑制M1型AM的极化,抑制AM内HMGB1的分泌来减轻LPS所致ALI。(3)HMGB1可通过激活AIM2炎症小体复合物和促进AM的M1极化来参与LPS所致ALI的炎症反应过程。(4)在LPS所致ALI中,HMGB1激活AIM2炎症小体复合物和促进巨噬细胞的M1极化的作用可能是通过TLR2、TLR4、RAGE和NF-κB通路来实现的。