补阳还五汤调控Cav1mTORULK1通路介导的自噬抗脑缺血损伤机制研究.doc

补阳还五汤调控Cav1/mTOR/ULK1通路介导的自噬抗脑缺血损伤机制研究缺血性中风是一种严重威胁人类健康的脑血管疾病,具有高发病率、高致死率和高致残率特点,是当前神经科学急需解决的课题。目前,虽然随着诊疗技术的不断提高,但对于该病仍缺乏有效的治疗手段。因此,阐明缺血性中风的发病机制并寻找有效的治疗方法显得尤为紧迫。既往医学界已经达成共识,脑缺血后缺血灶内存在缺血核心区和周围半暗带,核心区细胞死亡方式以坏死为主,为不可逆性损伤,而半暗带内细胞则以凋亡占主导,为可逆性损伤,据此,抑制半暗带内细胞凋亡是该病治疗的关键环节。然而,越来越多研究发现,广谱Caspase抑制剂抗凋亡治疗并未减轻脑缺血所致脑损伤程度。自噬作为一种细胞内溶酶体依赖的降解途径,近年来大量文献报道脑缺血后半暗带内细胞存在明确的自噬现象,并且先于凋亡发生,同时与凋亡存在相互作用,在脑缺血损伤中扮演了重要角色,但其作用尚不明确。因此,进一步观察自噬在脑缺血后半暗带组织中的激活情况及变化规律,同时明确其在脑缺血损伤中的作用,将有助于为缺血性中风的防治寻找新的有效靶点。国内外研究报道小凹蛋白-1（caveolin1,Cav1）参与了肺上皮细胞、乳腺癌等多种细胞自噬的调控,同时,有学者发现Cav1基因敲除加重了脑缺血损伤。那么,Cav1是否参与了脑缺血后半暗带细胞自噬的调控?若参与,其机制又如何?目前尚未阐明。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）/Unc-51-样激酶1（unc-51-likekinase1,ULK1）通路作为脑缺血状态下调控自噬的关键通路,脑缺血后Cav1是否通过mTOR/ULK1通路调控脑缺血后半暗带自噬进而发挥抗脑缺血损伤作用?因此,我们拟在永久性大脑中动脉阻塞（permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pMCAO）小鼠模型基础上,通过Cav1基因敲除,在整体动物水平明确Cav1在脑缺血后半暗带自噬中的调控作用及可能机制。补阳还五汤（BuyangHuanwuDecoction,BHD）是清代名医王清任用来治疗中风后半身不遂的经典名方,我们现代常用来治疗缺血性中风,取得了较好的临床疗效。大量研究表明该方具有很好的脑保护作用,但其作用机制尚不完全清楚。因此,进一步证实并阐明该方的抗脑缺血损伤作用及机制,对缺血性中风的防治具有重要的现实意义。本研究主要由四个部分组成。第一部分:基因敲除小鼠鉴定繁育方法的建立,以及Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠脑内的表达与定位检测;第二部分:观察脑缺血后半暗带组织中自噬的激活情况及变化规律,同时明确半暗带自噬在脑缺血损伤中的作用;第三部分:阐明Cav1在脑缺血后半暗带自噬调控中的作用及可能机制;第四部分:通过药物预处理的方法,从Cav1/mTOR/ULK1通路介导的自噬角度探讨补阳还五汤抗脑缺血损伤的可能作用机理。第一部分基因敲除小鼠鉴定繁殖方法与Cav1在脑内表达定位目的:探讨Cav1基因敲除小鼠的鉴定方法与最优繁育方式,观察Cav1在正常C57BL/6野生型（wildtype,WT）小鼠脑内的表达与定位情况,为深入研究Cav1在脑缺血损伤中的作用及机制提供理想的动物模型。方法:根据美国杰克逊实验室（JacksonLaboratory）提供的引物序列,运用普通聚合酶链反应（polymeasechainreaction,PCR）法扩增鼠尾基因组DNA、琼脂糖凝胶电泳检测Cav1基因敲除小鼠子代基因型;通过Cav1杂合子互交、杂合子与Cav1纯合子杂交（正交及反交）、纯合子互交4种不同的配种方式,观察亲代小鼠的受孕情况及子代小鼠基因型纯合情况;采用免疫组织化学（immunohis-tochemistry,IHC）法检测Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠脑内的表达情况及分布区域。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物分子量大小约为200bp和661bp,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了Cav1基因敲除小鼠的不同基因型;杂合子互交、杂合子与纯合子正交及反交、纯合子互交四种不同繁殖方式所产子代小鼠的基因型分布基本符合孟德尔遗传定律,子代小鼠纯合率分别为23.52%、47.36%、52.54%、100.00%;雌性、雄性Cav1基因敲除纯合鼠具有一定的繁殖能力,杂合子互交雌鼠受孕率为100.00%,杂合子与纯合子正交、反交雌鼠受孕率均为87.50%,纯合子互交雌鼠受孕率为75.00%,杂合子互交与其余三种繁殖方式的雌鼠受孕率比较,差异均具有统计学意义（P均﹤0.05,n=8）;Cav1表达部位主要位于细胞膜及细胞浆,在神经元、神经胶质细胞、内皮细胞中均可见其表达,神经细胞中尤其丰富,广泛分布于皮层、纹状体、室管膜下区、海