福菜乳杆菌新亚种的鉴定.doc

福菜乳杆菌新亚种的鉴定本课题组在完成国家自然科学基金面上项目（31170007,2012.01-2015.12快速检出中国传统泡菜中的乳杆菌并鉴定其中的新种和新质粒）的时候,在重庆农家自制泡姜中发现了乳杆菌CQ16Z1菌株。通过16SrRNA和rpoA基因序列比对分析,菌株CQ16Z1归属于福菜乳杆菌（Lactobacillusfutsaii）,然而pheS管家基因克隆测序及序列分析结果表明菌株CQ16Z1和Lactobacillusfutsaii有较大差异（相似性仅为74.05%）,和食窦魏斯菌CH2菌株的相似性更高（相似性为98.35%）。根据上述实验数据,我们推测菌株CQ16Z1可能是福菜乳杆菌的亚种并对其展开鉴定工作。目的采用多相分类法系统鉴定菌株CQ16Z1。材料与方法1.乳杆菌的分离鉴定结合MRS半选择培养基,革兰氏染色及乳杆菌PCR快速检出技术,筛出乳杆菌菌株。2.菌株的表型特征通过扫描电镜观察菌株形态特征;进行乳杆菌属特征性生理生化实验;采用广泛运用于乳杆菌属鉴定的API50CHL系统来测定乳杆菌对49种碳水化合物的利用情况。3.菌株的系统发育学特征利用16SrRNA、rpoA和pheS管家基因克隆测序和序列分析并构建系统进化树。4.菌株的基因型特征在基因型特征的研究方法中采用G+Cmol%含量测定、DNA-DNA杂交实验及DNA扩增片段长度多态性分析（AFLP）技术。5.化学分类法鉴定使用薄层层析（TLC）检测方法检测细胞壁的化学组分;气相色谱（GC）检测细胞全脂肪酸组成。结果1.通过MRS半选择培养基、革兰氏染色结合乳杆菌PCR快速检出技术,筛出一株乳杆菌菌株,命名CQ16Z1。2.从菌株表型特征讲,菌株CQ16Z1在37℃的条件下,于MRS培养基上培养24h后,扫描电镜下观察到细胞大小为（0.5-0.6）×（2.2-4.6）μm,排列方式为单个或成对排列。生理生化方面,菌株CQ16Z1为革兰氏阳性菌,不运动,不液化明胶、不产生硫化氢和吲哚及过氧化氢酶阴性的兼性厌氧型的长杆状杆菌。3.从系统发育学角度看,菌株CQ16Z1在基于16SrRNA构建的系统发育树上,归属于福菜乳杆菌群。同时,基于16SrRNA、rpoA和pheS这三个基因构建的进化树关系看,该菌株可以代表福菜乳杆菌的亚种。4.从基因型方面看,菌株CQ16Z1的G+Cmol%含量为39.1%,在乳杆菌属G+Cmol%含量32-53%范围中;该菌株与福菜乳杆菌模式菌株LactobacillusfutsaiiJCM17355^T的DNA-DNA杂交率是91.9%;结合DNA扩增片段长度多态性分析（AFLP）,从基因角度支持该菌株归属于福菜乳杆菌群,而且可以代表福菜乳杆菌的亚种。5.从化学分类学方面看,菌株CQ16Z1的细胞壁不含有LL-DAP,meso-DAP和DD-DAP,细胞壁糖组分主要是核糖、葡萄糖、半乳糖;全细胞脂肪酸分析结果示主要脂肪酸为C_16:0,C_18:1ω9c和Summedfeature7(C_19:0cycloω10c/C_19:1ω6c/C_19:1ω7c)。对比分析与其亲缘性相近菌株的细胞壁化学组分及主要脂肪酸,结果表明从化学分类角度也支持将其划分为福菜乳杆菌的亚种。结论综上所述,菌株CQ16Z1能够被鉴定为福菜乳杆菌的亚种,命名为Lactobacillusfutsaiisubsp.chongqingiisubsp.nov,即福菜乳杆菌重庆亚种（CQ16Z1^T=CCTCCAB2017187^T=KCTC21089^T）。