无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达.doc

无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达黑曲霉作为一种重要的工业生产菌株,已逐步开发成为一种重要的酶表达系统。在本研究中,首先选择一株低蛋白背景且潮霉素敏感菌株为表达宿主,并对农杆菌介导转化法和PEG-原生质体转化法进行条件优化,然后以脂肪酶为模式酶在黑曲霉中进行同源/异源脂肪酶的表达。通过转录和转录后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶ANL的表达量,并进行了酶学性质研究。最后初步开展了CRISPR/cas9技术在黑曲霉表达系统中的应用,构建了尿嘧啶缺陷型菌株。主要结果如下:（1）对农杆菌介导转化和PEG-原生质体转化两种方法进行了条件优化。优化后农杆菌介导转化的条件是不萌发的新鲜孢子与OD₆₀₀培养至0.9-1.0的农杆菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol·L^-1的IM平板上,23^oC避光培养48h后进行转膜。最佳转化效率大约为每10⁶个孢子获得60±5个转化子,并且阳性率保持在90%以上。原生质体制备条件为:10⁷个?mL^-1黑曲霉孢子接种PDA浸提液,30^oC,200r·min^-1培养24h,收集菌丝体,按质量体积比1:10加入裂解酶液(0.8mol·L^-1MgSO₄,1%纤维素酶,0.5%蜗牛酶,0.25%溶菌酶),37^oC,120r·min^-1酶解2.5h后收集原生质体,获得原生质体个数约6.8×10⁵个?mL^-1,原生质体再生率约63±2.5%。（2）将同源及异源蛋白在黑曲霉中进行表达,异源华根霉脂肪酶RCL在黑曲霉CICC2169中未能表达,同源黑曲霉脂肪酶ANL可以表达但表达量较低。启动子转录水平分析,诱导型启动子glaA转录水平相比于野生型提高50.35倍,而组成型启动子gpdA转录水平相比于野生型提高994.86倍。尝试3种方式来提高ANL的表达水平,包括补充内含子（提高mRNA的稳定性）、添加kozak序列（增强翻译效率）、不同信号肽（增强蛋白胞外分泌效率）。在均是glaA为信号肽的前提下,改造之前初始转化子检测不到酶活力,单补充内含子的转化子酶活约为75.80U?mL^-1,单添加kozak序列的转化子酶活约为61.33U?mL^-1,信号肽的影响效果为cbhⅠsignal>ANLsignal>glaAsignal。整合三种策略,表达最好的转化子为kocbhS-ANL1000,最高酶活达到314.67U?mL^-1。在含有kozak序列的前提下,具有glaA、ANL、cbhⅠ信号肽的补充内含子转化子比相应的不含内含子转化子脂肪酶发酵活力分别提高了1.64倍、1.94倍、3.61倍。酶学性质研究表明ANL最适pH为3.0,最适温度为45^oC。（3）将CRISPR/cas9基因编辑技术在黑曲霉中应用,将CRISPR/cas9质粒通过原生质体转化法向黑曲霉转化并筛选转化子。sgRNA靶向pyrG基因,筛选转化子获得尿嘧啶缺陷型菌株（?pyrG）,通过测序确定突变位点,确定是位于sgRNA区域内,打靶效率约25%。sgRNA靶向hyg基因,尝试通过CRISPR靶向hyg基因进行破坏,但是未获得阳性转化子。