小麦矮秆基因同源序列的克隆与BAC源合池的构建.doc

小麦矮秆基因同源序列的克隆与BAC源合池的构建太谷核不育小麦是我国1972年发现的一份珍贵小麦材料，其不育性受显性单基因控制。它是世界上发现的第一份小麦显性核不育材料，具有巨大的经济价值和理论研究价值。矮败小麦是具有矮秆基因标记的显性核不育材料，其显性不育基因Ms2与显性矮秆基因Rht10紧密连锁，二者之间的连锁交换率不超过0.18％。本研究采用RT-PCR、等位特异PCR、构建和筛选BAC混合池等技术，获得了一个与Rht-D1c(Rht10)关系密切的矮秆基因，这一结果为最终分离矮败中国春小麦中的不育基因奠定了基础。实验所用材料为以中国春为轮回亲本回交十代的矮败中国春小麦。根据普通小麦中与矮秆基因Rht-D1b(Rht2)等位的野生型基因Rht-D1a序列设计合成了六对相互重叠的特异性引物，采用RT—PCR技术分别从矮败中国春小麦矮秆和高秆材料中扩增出六段大小不同的产物，经克隆测序后，通过引物拼接的方法获得了两个矮秆基因的同源序列，分别暂定名为Rh和H基因。与GenBank数据库中已知序列的比对分析表明，它们在氨基酸序列上分别与普通小麦、大麦、玉米、水稻和拟南芥等物种中调节赤霉酸反应的相关序列具有很高的同源性，进一步说明二者为赤霉酸代谢途径相关基因。Rh基因及普通小麦中已克隆的矮秆基因Rht-B1b和Rht-D1b与打基因在氨基酸水平上的比对分析表明，在七个重要功能区(Ⅰ-Ⅶ)内，这三个矮秆基因与H基因只在功能区Ⅰ中存在有差异。Rh基因与Rht-B1b和Rht-D1b基因都是由于核苷酸替代作用导致产生了终止密码子，从而在整个核苷酸序列上由终止密码子分隔成两个相互独立的开放阅读框，进而产生了功能上的改变；而H基因在整个核苷酸序列上则为一个完整的开放阅读框。Rh基因与Rht-B1b和Rht-D1b基因相比，除发生上述变化外，其功能区Ⅰ的5’端比二者还缺少了16个氨基酸。根据Rh基因与H基因在5’端第25个核苷酸上的差异设计合成等位特异性引物，分别以矮秆和高秆单株基因组DNA为模板，进行等位特异PCR检测。结果筛选出一对在所有矮秆单株中均有特异性扩增，而在所有高秆单株中均无特异性扩增的等位特异性引物，特异扩增产物在700-800bp之间，因此可将这对引物看作为Rh基因的一个共分离标记。Rh、Rht－BIb和Rht－DIb基因与H基因在氨基酸水平上的比对分析及矮秆和高秆材料等位特异性检测结果表明RhtDIC（Rh］0）可能是一个复等位基因，而Rh是该复等位基因中的基因之一。按照张洪斌博士并结合Clemson大学构建BAC文库的方法，以pECBAC为载体，回交十代的矮败中国春小麦矮秆幼苗为材料，构建了矮秆材料的BAC混合池。共收集了63个混合池，约2万个BAC克隆。插入片段大小和空载率的检测结果表明，在含有插入片段的克隆中，片段大小分布于25－150kb之间，平均为87kb左右，而整个BAC池的空载率约为10％。克隆稳定性检测结果表明，插入片段可以在宿主大肠杆菌中稳定保存至少100代。