几类腙类和酰亚胺类化合物抑制FBA-Ⅱ生物活性及其构效关系研究.doc

几类腙类和酰亚胺类化合物抑制FBA-Ⅱ生物活性及其构效关系研究在糖酵解以及糖异生途径中,果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13,FBA,Fructose-1,6-bisphosphatealdolase)能可逆地催化二羟丙酮磷酸(DHAP)和3-磷酸甘油醛(GAP)的醛合反应,生成果糖-1,6-二磷酸(FBP)。对于FBA-Ⅱ活性的抑制,会阻碍整个糖代谢过程,甚至引发物种的死亡。根据对底物DHAP的催化作用机制的不同,FBA可以分为两类：Ⅰ型FBA(FBA-I)和Ⅱ型FBA(FBA-Ⅱ)。C.albicansⅡ型FBA(Ca-FBA-Ⅱ)和CyanobacteriumⅡ型FBA(Cy-FBA-Ⅱ)已经被证明可以作为设计相应杀菌剂和杀藻剂的潜在靶标。本论文将以Ca-FBA-Ⅱ、Cy-FBA-Ⅱ为研究对象,首先利用表达纯化、酶动力学等生物方法构建Ca-FBA-Ⅱ酶体抑制剂筛选体系,并利用该体系进一步测试了几类腙类化合物对Ca-FBA-Ⅱ的抑制活性并分析其构效关系,最终得到一些新型结构、选择性高并且对C.albicans菌体生长有较好抑制效果的抑制剂。同时,以Cy-FBA-Ⅱ为研究对象测试苯甲酰亚胺衍生物对Cy-FBA-Ⅱ的抑制活性并进行了构效关系研究,还对抑制活性最高化合物进行了选择性分析。具体研究内容如下：1.在大肠杆菌体内进行Ca-FBA-Ⅱ异源表达,利用亲和层析方法纯化得到目的蛋白Ca-FBA-Ⅱ,并通过SDS-PAGE凝胶电泳方法分析验证其纯度>90%,求得蛋白产量为45mg/L。2.对Ca-FBA-Ⅱ的酶动力学性质进行研究,摸索得到Ca-FBA-Ⅱ最适温度为37℃,激活金属离子为K+、Zn2+,加入一定量的EDTA后,酶活丧失。最适GPDH、TIM浓度分别为2.5U/mL、1.25U/mL,建立了Ca-FBA-Ⅱ的酶活测试体系。测定了Ca-FBA-Ⅱ的酶动力常数Km,Vmax,得至Vmax=69.7U,Km=60.5μM。3.以Ca-FBA-Ⅱ为研究对象,对三个系列的苯肼、酰腙和苯腙类化合物进行了50μM终浓度的初筛,对于初筛抑制率较高的化合物求取其ICso值,I系列化合物IC50值最小的为I-20小分子,其值为300nM,I-20的C.albicans菌体抑制MIC80为16μg/mL,并且I-20对Ca-FBA-ⅡRa-FBA-I表现出的选择性大于600倍；Ⅱ、Ⅲ系列化合物IC50值最小的为Ⅲ-6小分子,其值为2.7州。后续对化合物进行了构效关系分析并使用分子对接等方法对I-20和Ⅲ-6小分子的结合方式作出初步探索,为后续发现更高效的抑制剂奠定了基础。4.以Cy-FBA-Ⅱ为研究对象,测试了Ⅳ系列苯甲酰亚胺类衍生物对Cy-FBA-Ⅱ的抑制活性,通过构效关系分析化合物基团变化对抑制活性的影响,测试得到化合物Ⅳ-10对Cy-FBA-Ⅱ和Ra-FBA-Ⅰ表现出的选择性高于30倍,并运用分子对接的方法初步得到了Ⅳ-10(IC50=1.7μM)与Cy-FBA-Ⅱ的结合模式。