巴参菜活性多糖制备及抗肿瘤、保肝活性研究.doc

巴参菜活性多糖制备及抗肿瘤、保肝活性研究巴参菜(Talinumtriangulare(Jacq.)Willd)又名棱轴土人参、人参菜、菜用土人参,属马齿苋科土人参属,为多年生草本植物,原产于非洲、南美、印度等热带地区,具有极高的食用和药用价值,其在民间常用于抗肿瘤和治疗肝脏疾病。本文对巴参菜多糖(PolysaccharidesofTalinumtriangulare,TTP)提取工艺进行了优化,并采用体外抗氧化评价体系考察了其抗氧化活性；采用生化指标分析及组织病理学切片评价了TTP体内对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用及对四氯化碳诱导肝损伤模型鼠的保护作用；借助流式细胞仪及PCR等技术探讨了TTP免疫调节及抗肿瘤机制；利用柱层析技术对TTP进行了分级纯化,并用GC、IR和NMR等手段对TTP级分进行了结构表征,以探讨其活性的物质基础。本文主要研究结果如下：(1)TTP提取工艺优化：通过单因素试验和L9(34)正交试验优化巴参菜多糖TTP的提取工艺,以TTP得率为指标,确定了其最佳提取工艺为：提取温度100℃、提取时间2.0h、料液比1：25,从经济的角度看,考虑到得率及后续浓缩等因素,宜采用两次提取法,粗多糖TTP得率为14.99%。(2)TTP体外抗氧化活性评价采用H202/Fe2+体系、焦性没食子酸自氧化法结合总还原能力测定等,考察了巴参菜多糖的抗氧化性能。结果显示：巴参菜多糖具有较好的清除羟自由基(2.0mg/mL40%7,醇沉淀TTP级分,抑制率为89.80%)、超氧阴离子自由基(5.0mg/mL40%71醇沉淀TTP级分,抑制率为63.23%)等活性,并呈现出剂量-效应关系。(3)TTP对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫体系影响TTP对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用,200mg/kg·bw剂量TTP抑瘤率达49.07%：与模型组相比,200mg/kg·bwTTP处理组脾脏指数极显著升高(P<0.001),细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2含量亦极显著增加(P<0.01～0.001),宿主免疫力显著增强,表明TTP抗肿瘤机理与其免疫增强作用有关。(4)TTP对小鼠巨噬细胞免疫调节及对人肝癌HepG2细胞的抑制TTP可以明显激活小鼠原代巨噬细胞PMM,与空白对照组相比,200μg/mL剂量TTP能促进PMM增殖,其增殖率达135.39%,与阳性对照脂多糖的促增殖作用(5μg/mL,PMM增殖率146.46%)无统计学差异：TTP处理RAW264.7细胞后,其上清液中NO含量急剧增加(P<0.001),MMT试验及细胞流式结果显示上清液细胞毒性明显增强,各剂量TTP组对HepG2细胞抑制率达到或超过了60%：RT-PCR结果显示iNOS基因表达显著提高,与化学指标相吻合；TLR2/4基因表达亦显著增加,提示巴参菜多糖可通过TLR2/4受体通路激活巨噬细胞。(5)TTP对四氯化碳诱导的小鼠化学性肝损伤的保护作用TTP对小鼠CC14诱导的小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用,能显著抑制由于CC14中毒造成的GSH含量及SOD活性及脂质过氧化产物MDA的生成,200mg/kg·bwTTP给药的保肝效果与50mg/kg·bw水飞蓟素(临床用保肝药物)接近,TTP的保肝机理与其增强抗氧化酶活性,清除或抑制自由基生产及免疫调节活性有关。(6)TTP柱层析分离纯化及结构表征通过DEAE-52柱及SephadexG-100柱对TTP分离纯化,获得TTP-1与TTP-4两种均一多糖级分：TTP-4分子量为87.4kDa,以β-TTP糖苷键形式存在,β-消化反应表明多糖TTP-4中存在O-糖苷键,气相色谱显示TTP-4由Rha:Ara:Man:Gal以摩尔比为1.22：1.00：1.05：1.51比例形式存在,1H-NMR呈现出4个端基峰,进一步证实多糖TTP-4是由4种单糖组成的。