海湾扇贝多糖的提取、纯化及抗肿瘤活性研究.doc

海湾扇贝多糖的提取、纯化及抗肿瘤活性研究癌症是当前严重危害人类健康、威胁人类生命的主要常见病之一，并且逐渐全球化。天然生物来源的抗肿瘤活性药物具有广谱、高效、毒副作用小的特点，在抗癌药物的研发中占有非常重要的地位，其中，多糖类物质因生物活性广泛，而成为了医学领域国内外专家学者普遍关注的焦点之一。海洋是生命的起源地，高盐、高压、低温、光照不足的特殊环境使海洋生物体内的多糖与陆生生物相比具有很大的差别，因此，海洋抗肿瘤活性多糖的研究尤其引人瞩目。扇贝是重要的海洋生物资源之一，营养价值高且含有多种生物活性成分，在海洋抗癌药物研究中具有很好的应用和开发前景。本研究以海湾扇贝为原料，进行扇贝多糖的提取和纯化，并对其抗肿瘤活性进行研究，为扇贝多糖的进一步研究及应用奠定基础。主要研究结果如下：（1）海湾扇贝粗多糖的提取工艺研究：采用热水、二次浸提法提取海湾扇贝粗多糖，通过单因素试验和响应曲面法试验设计对海湾扇贝粗多糖提取工艺进行优化，确定了最佳提取工艺条件为浸提温度90℃、液固比50.0mL/g、浸提时间180min，在此条件下海湾扇贝粗多糖的平均提取率约为57.7mg/g。（2）海湾扇贝粗多糖纯化和分离技术研究：对海湾扇贝多糖的蛋白质脱除方法进行比较，结果表明75%乙醇沉淀结合TCA法处理能较好地去除多糖中的蛋白质，脱除率可以达到91.80%。DEAE-52纤维素离子交换层析分离结果表明海湾扇贝多糖由中性多糖和酸性多糖两部分组成，其中，酸性多糖为其主要成分，但酸性多糖的具体组成和结构还需要进一步研究。（3）海湾扇贝多糖体外抗肿瘤效果及机制研究：采用MTT比色法检测海湾扇贝多糖对体外培养的不同肿瘤细胞的增殖抑制作用，利用光学显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜及流式细胞仪观察、分析其对不同肿瘤细胞的细胞形态、显微结构、超微结构及细胞周期的影响。结果表明，海湾扇贝多糖对体外培养的肿瘤细胞具有直接的细胞毒性作用，能够抑制体外培养的小鼠黑色素瘤细胞株B16F10、人卵巢上皮癌细胞株SKOV3和人肝癌细胞株HepG2的生长；经20.0mg/mL海湾扇贝多糖处理后，三种肿瘤细胞的细胞形态、显微结构和超微结构均发生了改变，表现为细胞皱缩、透明度降低、细胞密度降低、膜结构改变、核结构改变、核内染色质固缩等，并可对细胞周期产生不同程度的阻抑作用，说明海湾扇贝多糖可通过对肿瘤细胞的直接作用而发挥抗肿瘤的效果。（4）海湾扇贝多糖体内抗肿瘤效果研究：通过建立小鼠肝癌细胞株H22腹水瘤荷瘤小鼠模型，以灌胃方式给予不同剂量的海湾扇贝多糖，进行海湾扇贝多糖体内抗肿瘤效果研究。结果表明每日灌胃150.0mg/kg、250.0mg/kg的海湾扇贝多糖能够抑制小鼠肝癌细胞株H22腹水瘤的形成，两种剂量条件下试验小鼠的生存期分别延长38.68%和32.92%，说明海湾扇贝多糖在适当剂量条件下具有体内抑制肿瘤细胞生长的作用。（5）海湾扇贝多糖免疫增强活性研究：结果表明，在试验剂量范围内，海湾扇贝多糖对试验小鼠的肝脏指数均无显著影响，但能明显提高脾脏指数、胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬指数和吞噬率以及脾脏T-淋巴细胞转化能力，其中每日灌胃100.0mg/kg、150.0mg/kg海湾扇贝多糖组小鼠的脾脏指数最高，分别为（3.8±0.4）mg/g和（3.7±0.5）mg/g，两者之间没有显著差异；每日灌胃150.0mg/kg海湾扇贝多糖组小鼠的胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均最高，分别为（3.4±0.5）mg/g、(49.70±1.09)%、0.90±0.20；每日灌胃100.0mg/kg、150.0mg/kg海湾扇贝多糖组小脾脏T-淋巴细胞增殖能力显著高于其他剂量组，刺激指数分别为1.25±0.10和1.22±0.15，且两组之间差异不显著。海湾扇贝多糖的免疫增强活性可间接起到抑制肿瘤细胞生长的作用，并具有较高的安全性。（6）海湾扇贝多糖抗氧化活性研究：体外试验结果表明，海湾扇贝多糖有较强的体外抗氧化活性，能够清除试验体系中的·OH、DPPH·和O2-·，并具有较强的还原能力；体内试验结果表明，海湾扇贝多糖能够显著提高试验小鼠肝、肾组织中的SOD、GSH-Px、CAT活力，降低MDA含量，提高机体的抗氧化能力。其中SOD活性以150.0mg/kg剂量组为最高，分别为（24.96±0.79）U/g·mass和（1.79±0.03）U/g·mass；GSH-Px活力以100.0mg/kg剂量组为最高，分别为（637.22±27.04）U/g·mass和（255.72±21.59）U/g·mass；CAT活力以150.0mg/kg剂量组为最高，分别为（6473.08±55.68）U/g·mass和（5269.41±47.02）U/g·mass；200.0mg/kg剂量组MDA含量