DNA测序技术介绍.docx

DNA测序技术DNA测序技术测序目的测定未知序列确定重组DNA的方向与构造对突变进展定位和鉴定比较争论进展历史70年月末，WalterGilbert制造化学法、FrederickSanger制造双脱氧终止法手动测序，同位素标记80年月中期，消灭自动测序仪〔应用双脱氧终止法原理〕、荧光代替同位素，计算机图象识别90年月中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳2023年完成人类基因组框架图测序原理化学修饰法测序原理化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反响混合物，经凝胶电泳分别。化学切割反响：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延长结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反响构成，每个反响含有全部四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延长所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反响中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反响得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高区分1思洛生物技术股份率变性凝胶电泳分别大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进展检测。测序方法生成相互独立的假设干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基消灭在可变终止端的时机均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所打算。在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进展电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中假设干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸挨次。高通量测序技术高通量测序技术〔High-throughputsequencing〕又称“下一代”测序技术〔“Next-generation“sequencingtechnology〕，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进展序列测定和一般读长较短等为标志。依据进展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序〔MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克隆〔PolonySequencing〕、454焦磷酸测序〔454pyrosequencing〕、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、离子半导体测序〔Ionsemiconductorsequencing〕、DNA纳米球测序〔DNAnanoballsequencing〕等。MPSS由LynxTherapeutics公司在90年月进展的MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS技术是“下一代”测序技术进展的先驱。MPSS是一种基于磁珠〔bead〕和接头〔adaptor〕连接和解码的简洁技术，测定结果短，多用于转录组测序，测定基因表达量。MPSS测定结果有序列偏好性而易丧失DNA中某些特定序列，且操作简洁，已渐渐淡出，被的方法替代。LynxTherapeutics公司于2023年和Solexa合并，随后被Illumina收购。PolonySequencing2DNA测序技术2023年哈佛GeorgeChurch试验室进展起来的，基于乳化PCR(emulsionPCR)和自动显微镜等技术的测序方法。相关技术已整合进ABI公司的SOLiD测序技术平台。454焦磷酸测序由454公司进展的并行焦磷酸测序方法。该方法在油溶液包裹的水滴中扩增DNA〔即emulsionPCR〕,每一个水滴中开头时仅包含一个包被大量引物的磁珠和一个链接到微珠上的DNA模板分子〔把握DNA浓度消灭的或许率大事〕。将emlusionPCR产物加载到特制的PTP板上，板上有上百万个孔，每个微孔只能容纳一个磁珠。DNAPolymerase在将一个dNTP聚合到模板上的时候，释放出一个PPi〔焦磷酸分子〕；在ATP-Sulfurylase〔ATP硫酸化酶〕催化下，PPi与APS生成一个ATP分子；ATP分子在Luciferas〔e荧光素酶〕的作用下，将luciferin〔荧光素〕氧化成oxyluciferin，同时产生的可见光被CCD光学系统捕获，获得一个特异的检测信号，信号强度与相应的碱基数目成正比。通过按挨次分别并循环添加四种dNPT，读取