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本发明公开了一种利用核酸外切酶III检测大肠杆菌O157:H7的方法和试纸条,该方法包括以下步骤:(1)将目标单链DNA和适配体加热,然后自然冷却至室温,得适配体?目标DNA双链;(2)取适配体?目标DNA双链与待测样品液混合,然后培养,离心,得上清液;(3)将所得上清液与发夹探针、核酸外切酶III混合,培养,结束后加热,冷却至室温;(4)取冷却至室温的溶液,添加到金标探针溶液中,孵育,得混合液;(5)将所得混合液滴到依序设有T线和C线的试纸条上,T线显色为阳性结果,T线不显色为阴性结果;所述T线固定有捕获探针,所述C线固定有质控线探针。与现有技术相比,本发明方法流程简单,试纸条检测灵敏准确。