原代神经细胞培养方法.doc

..8/8.神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点,而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件,观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。（2）取孵化8-12d的鸡蛋,用70%酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF,2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24h,未见神经突起生长。二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。1．材料和方法取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤,然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。鸡胚背根神经节的取材方法同前。剥除神经节被膜,用0.125%胰蛋白酶消化(37℃30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。接种第3d,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖,作用48h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次,每次更换一半新鲜饲养培养液。2.培养液成份种植培养液:80%Eagle'sDMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L);10%胎牛血清;10%马血清;NGF20ng/ml;谷氨酰胺100μg/ml。脱氧核糖核酸酶I40μg/ml。饲养培养液:95%Eagle'sDMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L,)；5%马血清；NGF20ng/ml；神经营养素1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。3．新生大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生大鼠背根节神经元接种后4h,大部分细胞可贴壁,呈圆形或椭圆形,直径8-14μm,胞体周围呈现一圈光晕。神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。接种后24h,大部分贴壁细胞开始长出突起。其中多数为具有多个突起的多极神经元,少数为双极和假单极神经元,突起细长,并可观察到突起末端的生长锥。除单个散布的神经元外,还常见到几个或多个神经元聚集在一起,它们向四周发出树枝状的神经突起。培养2-3d后神经元的突起逐渐增多并延长,形成稀疏的神经网络。随着培养时间的延长,神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加稠密,神经元胞体逐渐增大。大鼠背根节神经元可维持培养2个月。新生小鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠背根节神经元的形态结构和生