一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113388581A(43)申请公布日2021.09.14(21)申请号202110757009.7(22)申请日2021.07.05(71)申请人中国人民解放军海军军医大学第一附属医院地址200082上海市杨浦区长海路168号(72)发明人申晓军张新刘兆瑞郑瑞张隆江印慨(74)专利代理机构上海德昭知识产权代理有限公司31204代理人郁旦蓉(51)Int.Cl.C12N5/0793(2010.01)权利要求书2页说明书5页附图2页(54)发明名称一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法(57)摘要本发明提供了一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤1，神经节的消化分离：步骤1‑1，把SD小鼠的后背剪开并将神经节细胞剥离，步骤1‑2，将神经节冲洗、剪碎；步骤1‑3，加入消化液并在37℃的摇床中低速旋转进行消化，然后离心弃去消化液后加入贴壁培养基，吹匀得到悬浮液；步骤2，迷走神经元的培养：步骤2‑1，使用70μm过滤器对悬浮液进行过滤，步骤2‑2，用贴壁培养基将滤液稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，步骤2‑3，放入培养箱中培养，并用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，得到培养好的迷走神经元细胞。CN113388581ACN113388581A权利要求书1/2页1.一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，神经节的消化分离步骤，该步骤包括以下子步骤：步骤1‑1，把肥胖培养的SPF级Sprague‑Dawlcy小鼠的后背剪开，并借助解剖显微镜，用镊子将神经节细胞剥离，步骤1‑2，将剥离的所述神经节用Hanks盐平衡溶液进行冲洗，并将清洗后的所述神经节剪碎得到剪碎的组织；步骤1‑3，向剪碎的所述组织加入消化液并在37℃的摇床中低速旋转进行消化，然后离心弃去消化液后加入贴壁培养基，吹打均匀得到悬浮液；以及步骤2，迷走神经元的培养步骤，该步骤包括以下子步骤：步骤2‑1，使用70μm过滤器对所述悬浮液进行过滤，得到滤液，步骤2‑2，用贴壁培养基将所述滤液进行稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，轻轻混匀细胞，使细胞均匀铺在培养皿中，步骤2‑3，将所述培养皿放入培养箱中培养，在培养过程中使用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，弃掉贴壁培养基并更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，每两天更换新鲜的生长培养基，得到培养好的迷走神经元细胞。2.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑1中，所述Sprague‑Dawlcy小鼠是取自新出生30～40天、体重30～40g的，并且雌雄不限。3.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，剪碎的所述组织与所述消化液的质量体积为(0.2g～1g)：2ml。4.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，所述消化液为质量体积浓度为0.25％的胰蛋白酶。5.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，所述消化液包括体积比为1:1的胰蛋白酶和I型胶原酶，所述胰蛋白酶的质量体积浓度为0.25％，所述I型胶原酶的质量体积浓度为0.2％。6.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，进行所述消化的时间为40min～80min，进行所述吹打的过程包括：分别使用大、中、小三种不同口径的巴斯德管，先用大口径巴斯德管轻柔吹打所述组织，待所述组织变得柔软，更换中口径的巴斯德管轻柔吹打4～5次，使所述组织分成小块组织，更换小口径巴斯德管继续吹打，得到所述悬浮液。7.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤2‑3中，所述培养箱内的温度为37℃，CO2体积含量为5％。8.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，所述贴壁培养基为加入了胎牛血清的DMEM培养基，所述生长培养基为加入了B27添加剂、N2添加剂、生长因子EGF以及生长因子FGF的Neurobasal培养基。9.根据权利要求8所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，所述贴壁培养基中所述胎牛血清的体积分数为10％，所述生长培养基中，所述B27添加剂、所述N2添加剂、所述生长因子EGF以及所述生长因2CN113388581A权利要求书2/2页子FGF的质量比为2:1:1:1，所述生长培养基中的所述N2添加剂的浓度为1ug/10