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浅析大鼠CRH基因干扰慢病毒载体的构建论文浅析大鼠CRH基因干扰慢病毒载体的构建论文促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)由下丘脑室旁核(PVN)合成，促进腺垂体合成与释放促肾上腺皮质激素(ACTH)。CRH作为应激反应的中枢起始调节因子之一，在应激时含量明显增高。Plotsky等观察到大鼠新生期母婴分离引起的应激模型中PVN内CRHmRNA及CRH受体1(CRH-R1)表达明显增多。RNA干扰(RNAi)是一种通过降解靶基因mRNA使靶基因表达减少或沉默的技术，再结合慢病毒载体技术就实现了长期、稳定的基因沉默效应。本实验旨在筛选CRH基因的RNAi有效靶点，构建和鉴定CRH基因RNAi的慢病毒载体，为后期研究CRH神经元敏感化在应激反应中的作用及机制奠定基础。材料与方法一、材料包装细胞293T细胞株(吉凯基因公司);大肠杆菌菌株DH5α、DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine2000(Invitrogen公司);pEGFP-N1-3FLAGVector(BD公司);EcoRⅠ/BamHⅠ内切酶(上海吉凯基因化学技术有限公司);限制性内切酶、T4DNA连接酶(NEB公司);质粒DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒(Qiagen公司);MouseAnti-flag(1∶3000)(Sigma公司)。二、方法1.CRH基因过表达质粒构建载体GV143质粒XhoⅠ/KpnⅠ酶切后，化学合成目的基因。用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化学合成的含有目的基因的质粒，酶切产物电泳回收后进行定向连接，其产物转化DH5α大肠杆菌。选择单克隆进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序(上海吉凯基因化学技术有限公司)，比对正确的克隆即为构建成功的过表达质粒。用于菌落PCR鉴定转化子的引物为：(1)CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′;(2)EGFP-N-R：5′-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3′。2.RNAi病毒载体质粒构建针对CRHmRNA(NM_031019)，设计并合成4对针对CRH基因的小干扰RNA(siRNA)的核苷酸序列，同时设计并合成一段无意义序列作为阴性对照。挑取阳性克隆送至上海吉凯基因化学技术有限公司测序鉴定，构建的4种干扰质粒分别命名为KD1、KD2、KD3和KD4。该RNAi病毒载体可同时表达绿色荧光蛋白(GFP)，用于判断转染效率。根据Invitrogen公司的Lipofectamine2000使用说明共转染培养好的工具细胞293T细胞。3.CRH基因RNAi有效靶序列筛选分为三组：NC组共转染过表达质粒和阴性对照病毒载体质粒作为阴性对照;CON组为不转染任何质粒的293T细胞;KD组共转染过表达质粒和RNAi靶点病毒载体质粒(分为KD1、KD2、KD3、KD4，分别含有针对目的基因的不同干扰靶点序列的RNAi病毒载体质粒)。转染后24h荧光显微镜下观察转染效果，转染后36h收集细胞抽提蛋白，使用抗GFP抗体Westernblot法检测目的基因的表达情况，进而判断不同靶点的干扰效果。4.病毒包装293T细胞培养至活细胞达70%-80%时转染筛选出的干扰质粒和DNA溶液。把稀释后的干扰质粒和DNA混合液与稀释后的Lipofectamine2000于5min内混合，室温温育20min，于37℃细胞培养箱中培养。8h后倒去含有转染混合物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，弃洗液。每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的细胞培养基25ml，培养箱内继续培养48h。收集转染48h的293T细胞上清液，于4℃、4000g离心10min，收集上清液;将上清液以0.45μm滤器过滤后置于40ml超速离心管中，4℃、4000g离心10-15min，将病毒浓缩液移出。5.病毒生物学滴度测定测定前1d在96孔板铺板，每孔加4×104个293T细胞，体积为100腳莀__M_μl。用系列稀释的制备的病毒载体分别加入96孔培养板。24h后加入完全培养基100μl。4d后荧光显微镜观察荧光表达情况。根据荧光图片中GFP表达情况，计数最大稀释倍数孔中的带有荧光的细胞个数，计算病毒滴度(TU/ml)=(荧光细胞个数×转染时细胞数/100×每孔加入病毒稀释液体积)×1/稀释浓度。结果一、CRH基因过表达质粒构建CRH基因过表达质粒构建GV143载体进行XhoⅠ/KpnⅠ酶切。化学合成目的.基因，用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化学合成的含有目的基因的质粒得到565bp的片段，将其连入酶切载体中。挑单克隆PCR得到845bp的特异性条带。送200μl进行测序，测序结果与目标序列完全一致，表明CRH基因过表达质粒构建成功。将CRH基因过表达质粒转染293T细胞，收集细胞总蛋白。通过Weste