荧光和化学发光免疫分析方法.doc

荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性)，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。3、抗原抗体的结合体外抗原抗体反应又称血清学反应第一阶段为抗原和抗体的特异性结合，需时短，几秒至几分钟，无可见现象出现。第二阶段，可见反应阶段，表现为凝集、沉淀、细胞溶解等，时间较长，历时数分钟、数小时以致数天4、抗原抗体结合的特点（1）抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发生反应。抗原与抗体两者为非共价键结合，为可逆反应（2）抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应；以沉淀反应为例，分子比例合适，沉淀物产生既快又多，体积大。分子比例不合适，沉淀物产生少，体积小，或不产生沉淀物。（3）特异性抗原和抗体有相对应的极性基，抗原和抗体的特异性结合，也就是这些极性基的相互吸附。抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响。如有适当浓度的电解质存在，就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝聚或沉淀现象。若无电解质存在，则不发生可见反应。（4）合适的pH是抗原抗体反应必要的条件之一。pH过高或过低可直接影响抗原和抗体的理化性质。二、免疫分析1、定义免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。2、分类非标记免疫分析技术：免疫扩散、免疫电泳标记的免疫分析技术：酶免疫分析、放射免疫分析、其它免疫分析法（荧光免疫技术、胶体金免疫技术、发光免疫技术和铁蛋白免疫技术等）3、免疫标记技术3.1基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。3.2主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术三、荧光免疫分析(Fluorescenceimmunoassay,FIA)1、定义免疫荧光技术(FIA)是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。FIA以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合，但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。2、分类传统的荧光免疫分析受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰，分析灵敏度较低。在这个背景下，两种现代荧光免疫分析方法迅速发展。荧光偏振免疫分析法就是其中之一。它以其快速、精确和特异的优势很快便为人们广泛接受。时间分辨荧光免疫分析是另一种现代荧光免疫分析技术。2.1荧光偏振免疫分析方法(Fluorescencepolarizationimmunoassay,FPI