常用电泳技术.ppt

姓名：高源专业:生物化工学号：201420709Contents1.简介及发展过程最早发现于1808年。俄国物理学家Pehce于1809年在湿黏土中插上带玻璃管的正负极两个电极，加压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的黏土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。在1937年由瑞典科学家A.tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白。1948年Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化。电泳作为一种生化分离手段已广泛应用于生物大分子的分离、纯化、分析、制备以及用于测定它们的分子量、等电点等。已成为生命科学、医学、制药学、食品、生物工程、环境工程等领域常用的实验手段。2.电泳的原理783.影响电泳分离的主要因素1.蛋白质的性质3.溶液的性质（1）溶液的PH决定带点颗粒的电性和电量，对于氨基酸或蛋白质等两性电解质来说，溶液的pH值离其等电点越远，其净电荷量就越大，迁移速度加快。因此需选择合适的pH，使欲分离的各种蛋白质所带电荷的电性相同但是电量有较大的差异，以利于分离。（2）溶液的离子强度离子强度越低，欲分离组分的迁移速度越快；但离子强度太低则缓冲能力太小。合适的离子强度范围在0.02-0.2mol/L之间。（3）溶液的黏度电泳迁移率与溶液的黏度成反比，所以黏度不能过大或过小。4.其他因素（1）电渗现象在电场中液体（通常指水）对固体支持物的相对移动。电渗是由于电泳支持介质上含有带电基团，从而吸附流动相向正极或负极移动。电泳时，带电颗粒的迁移速度是颗粒本身的迁移速度与由于电渗携带颗粒的移动速度之矢量和。为消除电渗现象，可选择无电渗的电泳介质。（2）电泳的支持介质要求介质均匀，对样品吸附力小。吸附会延缓电泳分离。（3）温度电泳过程中会产热，造成样品的扩散及烧胶。因此需控制电压或电流，或安装冷却系统。按分离原理1.聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE1.电荷效应pI不同，在恒定缓冲系统中不同蛋白质间同性净电荷的差异。2.分子筛效应蛋白质分子的大小和形状的差异；蛋白质通过一定的分离胶时，受阻滞程度不同而表现出不同的迁移率。3.样品的浓缩效应在不连续的凝胶电泳中，样品首先经过大孔径的浓缩胶被浓缩，再经过小孔径的分离胶进行分离。浓缩胶与分离胶之间不仅存在凝胶孔径的不连续性，还存在缓冲液系统的不连续性。凝胶电泳的分类影响分离结果的因素2.凝胶浓度凝胶的分子筛效应与电泳分辨率、电泳速度密切相关，而凝胶的孔径大小决定于凝胶浓度，因此凝胶浓度的选择很重要。一般可根据样品中蛋白质的分子量范围选择合适的凝胶浓度。应用2.SDS-PAGE蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒，无形状差别，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以在SDS-PAGE中蛋白质分子仅存在分子大小的差异，于是可利用分子量差异将各种蛋白质分开，因此SDS-PAGE常用于测定蛋白质亚基的分子量和纯度鉴定。影响分离结果的因素蛋白质分子量的测定应用3.等电聚焦等电聚焦原理应用4.双向电泳（2D）双向电泳应用小结本章介绍了四种主要的电泳方法：区带电泳、移界电泳、等电聚焦、等速电泳，讨论了每种方法的应用实例，如SDS-PAGE和等。为解释蛋白和生物大分子在电场中的移动，我们采用源于胶体化学的固体颗粒模型。此模型采用双电层、zeta电势的定义以及表面结合离子层的概念。电渗现象和粘滞力会阻碍大分子的分离。稀溶液数学模型可用来确定分离时间以及区带电泳、等电聚焦和等速电泳中的带宽。ThankYou!