分子生物学：外源基因的原核表达1.ppt

外源基因的原核表达外源基因表达的作用：外源基因表达泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制、编码蛋白质的结构与功能的重要方法，也是制备和生产新型蛋白质药物、诊断试剂必不可少的手段。通过外源基因的表达可由宿主细胞产生大量的目的蛋白。常用的原核外源表达系统原核生物基因表达系统的特点：原核生物基因表达系统的特点：大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统的主要不足大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体构成大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体26六月2024大肠杆菌基因表达载体26六月202426六月2024终止子的功能（1）、能能有效控制目的基因mRNA的长度（2）、提高mRNA的稳定性（3）、避免载体上其他基因的异常表达大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体基因表达的机制基因表达的机制目的：在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖到一定的密度时，在某种特定的诱导因子的诱导下启动转录合成mRNA。mRNA的延伸与稳定性：有效表达的关键是：保持mRNA的1、有效延伸2、正确终止3、mRNA在细胞中的稳定存在mRNA的有效延伸：导致mRNA转录提前终止的可能原因有和解决办法1、衰减子：类似于简单的终止子，在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间。在构建表达载体时应避免该序列的存在。2、非特异终止：防止非特异性终止的方法是在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。转录的正确终止也是外源基因有效表达的重要因素，可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。mRNA在细胞中的稳定存在：mRNA在受体细胞中的稳定存在直接决定翻译产物的多少。解决办法1、原核生物：选择一个RNase缺失的工程菌株。2、真核生物：提高mRNA的正确加工外源基因mRNA的有效翻译表达蛋白在细胞中的稳定性外源基因在大肠杆菌中表达产物在细胞的位置：外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中。其表达形式包括形成：1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白大肠杆菌载体的表达方式1、非融合表达载体：应用此种载体表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋白质在结构、功能和免疫原性等方面基本或完全一致。目前上市的细胞因子类产品多采用此类表达载体。在进行融合表达时，一般将受体菌蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋白的方式表达后其稳定性大大增加。其原因为：外源小分子蛋白上的酶切位点暴露于分子的表面。当以融合蛋白的形式表达后，外源蛋白部分在菌体自身蛋白的引导下正确折叠，可最大程度上封闭酶切位点。带纯化标签的表达载体：载体上具有一段特殊序列，该序列表达后可作为纯化标签。目的基因与该序列融合表达后，用亲和层析的方法很方便的将目的蛋白分离，切除标签序列后可得到纯化的目的蛋白。分泌型表达载体：将目的基因与信号肽融合表达，表达蛋白在信号肽的引导下成为分泌蛋白。26六月202426六月202426六月2024宿主菌2、大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子；常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌基因表达受体菌株大肠杆菌高效表达目的基因策略表达相关元件的优化表达质粒的优化和设计构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3～6倍翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6～8个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5～7个碱基长度ATG与UAAGGAGG至少相隔3～4个碱基，与AAGAA至少相隔5个碱基；mRNA的翻译才能进行ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因mRNA5’端的二级结构，研究表明讨mRNA5’端形成的“茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱基的含量，降低mRNA5’端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下表达质粒的优化和设计在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特