分子生物学实验-质粒的提取和酶切鉴定.ppt

Theextractionandendonucleasecleavageofplasmid质粒的提取和酶切鉴定huangchunhong质粒为环状双链DNA，它是染色体DNA之外的单独复制单元。质粒一般存在于细菌细胞中，并常用于DNA重组，用于外源基因的克隆和表达。质粒的分类与构成pCDNA3.1/myc-His-IFT57重组质粒:6475bppCDNA3.1/myc-His：5497bp(讲义上错误)IFT57基因（intraflagellartransport57，鞭毛内运输蛋白)：1270bp酶切位点：BamHI:G^GATCC920bpEcoRI:G^AATTC941bp质粒提取：碱裂解法溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。质粒抽提：即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。如何去除RNA使用RNase消化(抽提中或者抽提后)。经过RNase消化后，RNA变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。如何将质粒与细菌基因组DNA分开利用NaOH/SDS完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组DNA都从细菌中出来，再利用质粒和基因组DNA在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因组DNA分开。去除蛋白质及其它杂质基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。提取步骤pcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液）pcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液）TheconcentrationandpurityofPlasmid反应物三、琼脂糖凝胶电泳胶浓度（％）琼脂糖凝胶电泳上样LoadingBuffer上样缓冲液结果分析