2、细菌分离培养、接种技术及生化.ppt

第三章临床细菌学检验技术第二节细菌分离培养与鉴定P35一、培养基的种类和选择(一)基本条件(二)培养基1.培养基的组成成分：⑵凝固物质：最常用的为琼脂(agar)，它是从石花菜中提出来的一种半乳糖胶，100℃溶解，40℃凝固，可利用琼脂来改变培养基的物理性状(固体或半固体)，它是理想的固体培养基的赋形剂，其本身不被细菌分解利用，也无营养作用。⑶抑菌剂和指示剂：不是细菌生长繁殖的必需物质，是制备细菌的选择、鉴别培养基和判断结果的需要。常用的抑菌剂有：胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。常用的指示剂有：酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国兰等酸碱指示剂，美兰为常用的氧化还原指示剂。2.培养基的分类基础培养基：是其他培养基的基础，如普通肉汤、普通琼脂平板、斜面、高层营养培养基：BAP、罗-琴培养基、吕氏血清斜面选择培养基：SS平板、BS平板、Mac平板等鉴别培养基：糖发酵管、MIU、KIA、TSI等特殊培养基：厌氧培养基、高渗培养基等3.常用培养基的制备⑶血琼脂平板：普通琼脂平板营养物质灭菌冷至50℃+5%~10%脱纤维SRbc或RRbc，摇匀，倾倒无菌平皿，冷凝后即成血平板。常用于营养要求较高的细菌的分离纯培养和药敏。⑷半固体肉汤：牛肉汤(牛肉浸膏汤)+0.2%~0.5%agar→加热溶化→分装→高压灭菌→冷却即成。常用于保存菌种和观察细菌的动力。二、分离培养（一）细菌的分离倾注平板法取一定量的稀释标本加入无菌平皿，再加入冷至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝后倒置培养。6.涂布法把稀释定量被检菌液均匀涂布于琼脂平板表面。7.定量接种环法把定量接种环沾取菌液均匀涂布于琼脂平板表面。(二)细菌的培养方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养，常用培养方法有：1.需氧培养：适用于需氧菌和兼性厌氧菌，在有氧环境下35℃孵育18~24h。2.CO2培养：适用5%~10%CO2环境才生长良好的细菌，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布鲁菌的首次分离培养。供给CO2的方法有：CO2培养箱、烛缸法、化学法(每升容积0.4gNaHCO3+0.35ml浓HCl)。3.厌氧培养法：适用于厌氧菌的分离培养，常用的方法有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱法等。2021/5/24(三)细菌的生长情况在平板上——呈菌落(colony)生长，常用于细菌分离纯培养在斜面上——呈菌苔或菌落生长，可用于增菌或保存菌种。半固体中——呈迁徙生长(有动力)。可用于观察动力和保种。在液体中——呈表面生长，均匀混浊生长和沉淀生长。可用于增菌和鉴别细菌。思考题三、生化反应（一）碳水化合物的代谢试验1.糖(醇、苷)类发酵试验产酸(+)：丙酮酸、乳酸、甲酸等原理：细菌糖类产酸产气⊕：CO2、H2不分解：(-)由于不同细菌菌体内的酶系统不同，可分解单糖（葡萄糖）,双糖（乳糖），多糖（淀粉）和醇类（甘露醇），糖苷（水杨苷），代谢产物也不一样，可借此来鉴别细菌。培养基：肉膏汤+1%待试糖+指示剂→溶化调pH7.4±→分装→高压灭菌冷后待用。有液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。方法：把分纯的细菌→1%糖(醇、苷)类培养基，35℃18~24h→观察结果。产酸产气：如大肠埃希菌→GS→结果+产酸不产气：如伤寒b、痢疾b→GS→+-培养基不变色：如卡他莫拉菌应用：是鉴别细菌最主要和最基本的试验，特别是肠杆菌科鉴定的主要试验。2.氧化-发酵试验(O/F试验)原理：分解GS—氧化型细菌，如微球菌、绿脓b细菌分解GS—发酵型细菌，如葡萄c、肠杆菌科不分解GS—产碱型细菌，如莫拉莫拉菌培养基：HL培养基(蛋白胨2g、NaCl5g、GS10g、agar2.5g、K2HPO4·12H2O0.3g、0.2%溴麝香草酚兰12ml、加蒸馏水至1000ml，调pH7.2）碱性时为绿色，酸性时为黄色。方法：将待测菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支滴加无菌液体石蜡(高度不少于1cm)，35℃培养48h。结果：应用：检测细菌的代谢类型，进而鉴别细菌。如肠杆菌科细菌为发酵型，而非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌(发酵型)和微球菌(氧化型)的区别。注意事项：①对营养要求高的细菌应在HL培养基中加入2%血清或0.1%的酵母浸膏。②阴性者要延长培养时间3~4天再观察结果。③指示剂不能用酒精溶解。3.β-半乳糖苷酶(ONPG)试验应用：本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。迟缓分解乳糖的细菌(宋内志贺菌等)只有β-半乳糖苷酶(胞内酶)，缺乏半乳糖苷渗透酶(胞外酶)或活性很低，故需几天才能将乳糖分解，若采用ONPG试验则可迅速(20~30min)得出结果。因为ONPG与乳糖十分相似，且分子较小，它不需半乳糖苷渗透酶则可进入细胞内，而被细胞内的β-半乳糖苷酶分解为半乳糖