基于Taqman微流控芯片技术高通量检测17种转基因玉米品系.docx

基于Taqman微流控芯片技术高通量检测17种转基因玉米品系徐君怡曹际娟郑秋月杨莉莉王永邹明强摘要将Taqman微流控芯片技术应用于实时荧光PCR平台的转基因玉米17种品系高通量检测。在一次PCR扩增过程中，以2个玉米内源基因（hmgA基因、adh1基因）和1个上样控制基因（18S基因）为内参照，可同时完成17种转基因玉米品系（TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、MIR162、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MON89034、MIR604、MON88017、T25）的单孔单重扩增的并行检测，检出限可达10～20copies。本方法特异性强，灵敏度高，与“金标准”单一的实时荧光PCR方法检测结果完全吻合，具有可多样品、多靶标平行检测的优势，为转基因产品多品系混杂鉴定检测提供了高效、快速的方法。采用本方法，从16批进境的实用玉米中检出9批转基因玉米样品，且发现其中不同程度的混杂含有1～8种品系。本方法可用于口岸进境实用农产品中多品系混杂转基因的高通量检测。关键词Taqman微流控芯片;转基因玉米;品系鉴定;多品系平行检测1引言玉米是世界上重要的粮食作物之一，其单位面积产量位居榜首[1]。近二十多年来，转基因植物培育取得突破，推出了一批新品种[2～5]。截至2018年底，总计70个国家/地区批准了可用于食物和饲料及释放至环境中的转基因作物进口，其中，玉米仍然是转化体获批数量最多的作物[6]。转基因作物及其产品中转基因成分的检测主要有蛋白质检测方法和核酸检测方法。核酸检测的目标通常为插入的外源DNA片段（即鑒定是否为转基因）或外源插入DNA同植物基因组之间的连接区序列（即转基因品系鉴定）;蛋白检测目标通常为外源目标基因表达的新蛋白。这两种检测方法因其较高的特异性和灵敏度，被用作转基因产品检测的常用方法[7]。但是，基于蛋白检测的方法有局限性，如目的蛋白稳定性不及核酸，在一些加工处理的产品中，蛋白通常已变性，很难检测到可能有的转基因成分;此外，蛋白抗体的制备成本较高，制备过程复杂，不适用于目前全球贸易市场上出现的越来越多的转基因作物品系及复合品系的筛查和检测。聚合酶链反应（PCR）是目前转基因生物核酸检测的主要方法，实时荧光定量PCR（qPCR）已成为转基因定性和定量检测的“金标准”[8，9]。转基因作物及其产品中转基因成分的检测、鉴定和定量分析需采用复杂的多步骤程序。首先，初筛阶段检测样品是否含有任何转基因成分，即通过筛查检测植物转化体中广泛使用的调控元件，如CaMV35S启动子、NOS终止子等[10];其次，当筛查检测到存在转基因成分时，必须确定转基因生物的品系，以便核查其生物安全证书状态。此步骤使用的检测方法是针对转基因品系进行特异性鉴定，即外源插入基因同植物基因组之间的连接区序列。对于未经批准的转基因生物品系，则需按照相关规定进行处理。不同国家对于转基因产品的检测阈值有不同的规定，但我国并没有规定阈值限量，唯检出或未检出，未经批准商业化种植或未经审批进境的转基因品系存在极大的生物安全性风险隐患，因此，开展转基因品系鉴定具有极其重要的现实意义。随着食品和饲料产品中转基因转化事件数量的不断增加，在一个PCR反应中检测多个转基因转化事件将加快检测速度并提高检测效率[11～13]。然而，由于引物间的相互干扰和某些靶点的优先扩增，使得多重PCR的扩增条件的优化难度较大。实际上，多重qPCR并未被转基因检测实验室广泛应用于常规检测中。对于进境玉米、大豆等实用农产品业务量大的海关口岸检测机构，实用农产品中多种转基因品系混杂的品系鉴定检测是最普遍、最繁琐的工作，因此，需要研发一种简单快捷、灵敏准确的高通量品系鉴定检测方法。微流控芯片是由Manz等[14]在20世纪90年代首次提出并发展起来的跨学科分析技术。通过微加工技术，将常规实验室的多个操作平台集成在一张芯片完成，具有高度集成、样品和试剂消耗量少、反应速度快、可大量平行处理的优点，在生物、化学和医学等领域表现出巨大的发展潜力[15～19]。目前，微流控芯片技术已被广泛用于细菌定量检测[20]、基因扩增与分析[21～23]和蛋白质检测[24]等领域。Kodani等[25]应用微流控芯片在278个临床样品中同时检测21种呼吸道病原体;Liu等[26]利用微流控芯片同时检测19个肠道病原靶标;Rachwal等[27]利用微流控芯片同时检测23种病原细菌;周杰等[21]利用微流控恒温扩增碟式芯片在65℃恒温条件下对转基因样品中的P-CaMV35S、T-NOS等10种筛选靶标基因进行同步检测，检出限可达到0.5%（m/m），实现一次上样即可完成样品的转基因成分筛查。Taqman微流控芯片是一种384孔板结构的qPC