糖尿病心肌病患者血清差异表达microRNA及作用的研究.docx

糖尿病心肌病患者血清差异表达microRNA及作用的研究郭润民+刘畅+吴子君+姜佳美+吴斌+莫海亮+黄瑞娜+何松坚+李腾+闫海+李上海+游琼+吴铿[摘要]目的筛选糖尿病心肌病患者血清差异表达的microRNA（miRNA），明确miR-186-5p和miR-516a-5p在DCM发生发展中的作用和机制。方法选择30例DCM患者为实验组，60例年龄相当的身体健康者为正常对照组，分别从两组随机选取3例作为研究对象行microRNA芯片初筛差异表达miRNA，然后荧光定量qPCR验证这些miRNA的差异表达；在高糖诱导人AC16心肌细胞损伤模型中，miR-186-5p和miR-516-5p的mimics和inhibitors分别干预，观察对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。结果microRNA芯片检测发现，糖尿病心肌病患者血清有51个差异表达的miRNA，经荧光定量qPCR验证为miR-186-5p、miR-516a-5p等8个差异表达miRNA；显著高表达的miR-516-5p和明显低表达的miR-186-5p介导了高糖所致心肌细胞毒性损伤。结论糖尿病心肌病患者血清miRNA表达谱发生改变，有8个差异表达miRNA，miR-516a-5p和miR-186-5p可能参与糖尿病心肌病的心肌损伤发病过程。[关键词]microRNA；糖尿病；糖尿病心肌病；心肌损伤糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DCM）是独立于高血压、冠心病及心脏瓣膜病变的一种糖尿病心脏并发症，与糖尿病患者心血管疾病的高发生率及高病死率密切相关，越来越受到重视。糖毒性、脂毒性、氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、心肌细胞凋亡、炎症等众多因素与DCM心肌损伤密切相关，其中心肌细胞凋亡与炎症是DCM的主要发病机制之一，然而具体分子机制尚不清楚。MicroRNA（miRNA）是22-24nt的一种非编码RNA，能通过碱基配对的方式特异性结合目的mRNA3非编码区域负性调控其表达，在细胞分化、增殖、代谢、细胞凋亡和迁移等生物学活动中发挥一定作用。新近研究表明：MicroRNA在心脏纤维化、心律失常、心肌缺血、心衰等心脏疾病中具有重要作用；体内外实验研究提示，MicroRNA表达异常可能在糖尿病心肌病发病机制中起到重要作用。因此，为了深入阐明DCM心肌损伤的发病机理，为了明确MicroRNA在DCM心肌损伤中的具体作用与机制，本研究拟采用microRNA芯片筛选DCM患者血清差异表达miRNA，并且荧光定量qPCR验证之；在高糖诱导人ACl6心肌细胞损伤模型中，使用miRNA的mimics和inhibitors分别干预，观察对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。1材料与方法1.1材料D-葡萄糖购自美国Sigma-Aldrich公司。胎牛血清（GIBICO），DMEM培养基（Hyclone），青链霉素（Hyclone），胰酶（Hyclone），PBS磷酸钾缓冲液（Hyclone）。miR-186-5pinhibitor、miR-186-5pmimics、miR-516a-5pinhibitor、miR-516a-5pmimics（广州锐博生物科技有限公司），miRcntemiRNA提取分离试剂盒、miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒、miRcntemiRNA荧光定量检测试剂盒（TIANGEN），Lipofectamine3000TransfectionReagent（Invitrogen公司），Opti-MEM培养基（Invitrogen公司），CCK-8（碧云天），30%丙烯酰胺混合溶液（碧云天）。人microRNA芯片版本为agilentV19。1.2方法1.2.1纳入研究的DCM患者一般资料与血液样本采集选择2012年6月～2015年7月期间在广东医学院附属医院心血管内科住院的糖尿病心肌病患者30例，健康组60例。诊断标准参照以往文献报道，具体如下：（1）确诊糖尿病病程5年以上；（2）心脏扩大、心力衰竭、心绞痛或心律失常存在；（3）无冠状动脉大小血管和微血管病变；（4）无其他原因的心肌病和心脏病。排除标准如下：（1）急性脑梗死患者；（2）自身免疫性疾病；（3）使用激素或免疫抑制剂者；（4）发病前2周有炎症、感染性疾病；（5）依从性差不能完成相关指标测定的患者。本研究经广东医学院附属医院伦理委员会审核通过，参与本研究的所有患者均签署了知情同意书。采集DCM患者外周静脉血10mL，将其置于不含抗凝剂的收集管中，室温静置30min后，4000r/min离心20min，离心留取上清低温冰箱保存备用。1.2.2人MicroRNA芯片筛查与qPCR验证采用人microRNA芯片（agilentV19）筛查DCM患者和健康对照各3例血清microRNA表达差异