体外诱导骨髓间质干细胞分化为心肌样细胞及其低免疫源性实验.docx

体外诱导骨髓间质干细胞分化为心肌样细胞及其低免疫源性实验【摘要】目的：研究体外诱导骨髓间质干细胞分化成心肌样细胞和其低免疫源性的相关性。方法：选取我实验室50只实验鼠进行对比研究，分别为单一反应细胞组、反应细胞+刺激细胞组和骨髓间质干细胞+反应细胞、骨髓间质干细胞+反应细胞+刺激细胞。结果：体外诱导后，部分的细胞结蛋白和心肌特异性肌钙蛋白表现出阳性反应，观察组1的抑制率显著低于对照组1，观察组2的抑制率显著高于对照组1。结论：骨髓间质干细胞具有潜在的分化功能，分化后骨髓间质干细胞对于异体淋巴细胞的增殖依赖性增强，因此具有低免疫源性，其在异体移植治疗中具有重要意义。【关键词】体外诱导；骨髓间质干细胞分化；低免疫源性据研究，骨髓间质干细胞是造血的重要基础，同时也具有多向分化的特点，可以分化出大量的造血之外的组织[1]。在相关研究不断深入的背景下，人们对于骨髓间质干细胞的认识开始逐步加深，认为其低免疫源性的独特性质也逐渐被人们了解[2]。近年来的研究显示，通过体外诱导骨髓间质干细胞而产生的脂肪细胞或骨细胞都不会表达组织相容性的复合物，在和同种的T淋巴细胞共同培养之下也没有对T细胞的增值产生明显的促进效果。此次实验为研究在经体外诱导后的骨髓间质干细胞分化为心肌样细胞后是否还存在免疫源性，为心肌梗死的细胞移植治疗提供依据，进行了对比研究，具体如下。资料与方法一般资料选取我实验室50只1月龄的实验鼠作为本次研究对象，时间从2013年5月-2015年5月。实验鼠体质量在100-120g之间，不区分雌雄性，实验过程中均在55%左右的湿度下培养。方法实验器材主要包括5-氮杂胞苷和不含小牛血清的调配溶液，在过滤除菌后于4℃环境下保存。此外还应用了干粉剂、链霉素、青霉素、心肌特异性肌钙蛋白T、抗结蛋白（鼠）、磷酸盐以及Eagle培养基（低糖改良）和RPMI-1640培养基（低糖改良）等。对实验鼠进行麻醉，然后于无菌环境下取其四肢长骨，将两侧的干骺端剪掉后，对骨髓腔进行冲洗，冲洗用试剂为Eagle培养液。将骨髓细胞悬液收集并在细胞培养瓶中培养，培养环境为37℃、55%湿度、0.05%二氧化碳浓度。在培养三天后置换培养瓶中一半的溶液，然后每隔一天置换一次。显微镜下观察培养基，当绝大多数（90%左右）贴壁细胞接近融合之后，采用磷酸盐冲洗以除去其中的血清成分，在采用胰蛋白酶消化后再次用显微镜观察，当观察到细胞变圆并且间隙加大后，去掉胰酶并加入含血清的培养基。最后将细胞悬液以1:2的比例进行接种传代。对传代5次后的培养成分接种在培养板上，进行免疫组化的检测，采用磷酸盐代替之前的检测试剂作为阴性对比。对传代5次之后的骨髓间质干细胞和血细胞计数，并以1×105密度将其接种于培养板上，当细胞实现了90%融合后，采用磷酸盐对其进行3次冲洗，再采用5-氮杂胞苷诱导1天时间，然后正常培养4周时间。选用96孔的细胞培养板，在每孔加入100L的反应细胞和刺激细胞，并于37℃和55%湿度下培养6天时间。于终止培养前的20小时内混合胸腺嘧啶核苷，并将所得培养细胞转移至玻璃纤维滤纸上，烘干滤纸后依次放入混合了闪烁液的塑料管中，对样品进行1分钟的自动测定从而得到每分钟的脉冲结果。对照组为反应细胞组，分为1、2两组，分别是单独的反应细胞和反应细胞结合刺激细胞；观察组为骨髓间质干细胞组，分为1、2两组，分别是骨髓间质干细胞混合反应细胞和骨髓间质干细胞混合了反应细胞及刺激细胞。评价指标抑制率=（对照组脉冲结果/分钟-观察组脉冲结果/分钟）/（对照组脉冲结果/分钟）×100%。统计学方法采用SPSS22.0统计学软件对所得数据进行分析处理。计量资料采用（x±s）表示，采用t值检验；计数资料采用%表示，采用x2检验。当P＜0.05时，对比差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果生长状况培养2天后，细胞主要为圆形形态，几乎都贴壁生长。培养7天后，细胞呈长梭状，呈集落生长形式。培养12天后，集落的细胞数量呈现显著的增多趋势，并且呈放射状扩散。在经过传代后，细胞数量进一步快速增长，多数的细胞为梭状，并且呈平行生长。诱导前鉴定骨髓间质干细胞的诱导在经过4周时间后，部分细胞开始死亡，并且细胞的形态在诱导之前变得更加狭长。通过免疫组化鉴定发现，培养的骨髓间质干细胞抗原为CD71，骨髓间质干细胞的CD44呈阳性，而造血干细胞表面抗原则表现为阴性。诱导后鉴定在体外诱导骨髓间质干细胞2周时间后，一部分细胞的结蛋白呈阳性表达，但心肌特异性肌钙蛋白则呈阴性表达。结蛋白的阳性比例接近30%。在体外诱导4周时间后，一部分细胞的结蛋白表现出阳性结果，心肌特异性肌钙蛋白也呈阳性结果。检测结果分化之后，骨髓间质干细胞对于同种的异体淋巴细胞表现出细胞增殖的依赖性。分化后的骨髓间质干细胞数量显著增加，对于淋巴细胞增殖产生了