翘嘴鲌精子生理特性及超低温冷冻的研究.docx

翘嘴鲌精子生理特性及超低温冷冻的研究打开文本图片集摘要：采用试验生态——显微观察方法对翘嘴鲌精子的生理特性进行了研究，并用两步降温法超低温冷冻保存翘嘴鲌精子，筛选出适宜的稀释液与抗冻剂配方。结果表明，翘嘴鲌适宜的盐度范围为0～0.4%，pH值为5.5～8.0时，精子激活率较高，其中pH值为5.5时，精子运动时间与寿命最长;翘嘴鲌精子在4℃条件下保存84h仍有48.33%的激活率，在25℃条件下保存84h时精子死亡。以D-15为稀释液、10%乙二醇（EG）为抗冻剂，采用两步降温法超低温冷冻保存翘嘴鲌精子，解冻后精子活力最高。关键词：翘嘴鲌;精子;生理特性;超低温冷冻;激活率翘嘴鲌属鲤科鲌亚科，为我国重要淡水名优经济鱼类。由于近亲繁殖、环境污染等原因，养殖翘嘴鲌的性状已出现不同程度的衰退。鉴于此，相关学者已对翘嘴鲌的耗氧率和窒息点[1]、生长特征[2-3]、个体生殖力[4]及营养需求[5-6]等进行研究，但关于翘嘴鲌精子生理特性及精子的超低温冷冻保存方面的研究尚未见报道。随着翘嘴鲌养殖产业的发展，精子生物学特性的研究显得尤为重要，将有助于加速其育种进程和产业化发展。与此同时，翘嘴鲌的遗传育种与优良种质资源的保存日益引起人们的重视，开展翘嘴鲌的精子冷冻保存研究，探索并改进保存方法，是其种质资源保护的有效途径之一，也能为翘嘴鲌遗传育种的研究提供优良种质材料。在鲌亚科鱼类中，此方面的研究未能引起足够重视，仅有对黑尾近红鲌（Ancherythroculternigrocauda）精子的相关研究，王贵英等以精子活力为指标，进行了黑尾近红鲌精子低温保存方法的研究，认为黑尾近红鲌精子最适的保存液配方为葡萄糖2.90g、KCl0.05g、CaCl20.02g、NaHCO30.21g、蒸馏水100mL、青霉素2.0×104IU/mL，此配方可以使精子在4℃条件下保存156h后活力仍达80%;并对黑尾近红鲌精子在不同盐度、不同水体及不同离体时间情况下的活力进行研究，筛选出黑尾近红鲌精子的最适盐度为0.5%，蒸馏水作为激活液好于自来水和池塘水，采用蒸馏水激活离体精子1～15h发现，随着时间的延长，精子快速运动时间无显著差异，而精子成活率显著降低，但这些试验均未涉及超低温冷冻保存方面[7-8]。在鲤科鱼类中，此方面的研究工作较多，除了有精子的生理特性[9]、超微结构观察[10]等方面的研究，也有关于精子超低温冷冻保存方面的探索。陈松林等以D-15为稀释液、8%～12%的二甲基亚砜为抗冻剂，超低温冷冻保存草鱼（Ctenopharyngodonidellus）、鲢鱼（Hypophthalmichthysmolitrix）、鲤鱼（Cyprinuscarpio）和团头鲂（Megalobramaamblycephala）的精子，获得的冷冻精子的活力分别为75%、75%、65%和65%[11]。丁淑燕等则选用Ringer液为稀释液、8%二甲基亚砜为抗冻剂，超低温冷冻兴国红鲤（Cyprinuscarpiovar.singuonesis）的精子，解冻激活后精子的活力达到了接近鲜精的水平[12]。本研究以浙江省淡水水产研究所综合试验基地养殖的翘嘴鲌精子为试验材料，探讨不同盐度范围、不同pH值范围、不同保存温度及保存时间对翘嘴鲌精子活力的影响，旨在为其科学研究和生产实践提供基础数据。并以0.25mL麦细管为冻存管、两步降温法研究了稀释液种类、抗冻剂种类与浓度对翘嘴鲌精子超低温冷冻保存效果的影响，旨在为翘嘴鲌精子超低温冻存技术的改进提供参考。1材料与方法1.1材料翘嘴鲌取自浙江省淡水水产研究所綜合试验基地，于2022年6月在此基地进行试验，挑选健康状况良好、体表无伤、无病且性成熟的雄鱼作为试验材料。1.2激活液配制（1）不同盐度溶液的配制。用纯水配制盐度分别为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%的NaCl溶液;（2）不同pH值溶液的配制。用NaOH或HCl调节纯水的pH值，分别配制pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的溶液。1.3稀释液配制（1）CCSE2。用电子天平称取NaCl0.3427g、蔗糖3.4314g溶于100mL纯水。（2）D-15。用电子天平称取NaCl0.80g、KCl0.05g、葡萄糖1.50g溶于100mL纯水。（3）鱼用任氏液。用电子天平称取NaCl0.780g、CaCl20.021g、KCl0.02g、NaHCO30.20g溶于100mL纯水。（4）Hanks液。用电子天平称取NaCl0.801g、KCl0.04g、CaCl20.014g、NaHCO3