慢性马兜铃酸肾病大鼠模型肾组织中蛋白质组的差异表达.docx

慢性马兜铃酸肾病大鼠模型肾组织中蛋白质组的差异表达【摘要】目的：制备慢性马兜铃酸肾病的大鼠模型，建立马兜铃酸肾病大鼠肾组织和正常大鼠肾组织的双向电泳图谱，从而展示差异表达的蛋白质，为进一步筛选介导马兜铃酸毒性作用的蛋白质分子奠定基础.方法：应用马兜铃酸腹腔注射制备大鼠慢性马兜铃酸肾病模型，提取其肾组织中总蛋白质，采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对模型组和正常组肾组织中蛋白质进行差异展示.结果：成功制备了慢性马兜铃酸肾病大鼠模型，并建立了模型组和正常组大鼠肾组织的双向电泳图谱，发现了差异蛋白质.结论：马兜铃酸导致大鼠肾组织中蛋白质差异表达，这些差异表达的蛋白质可能介导了马兜铃酸的毒性作用.【关键词】马兜铃酸；大鼠；肾组织；双向聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质组【中图号】0引言自Vanhrweghem等［1］报道了因减肥药引起“中草药肾病”以来，含马兜铃酸成分的中草药所致的肾损害马兜铃酸肾病越来越受到了国内外学者的广泛重视.由于一些常用中草药及中成药都含有马兜铃酸，因而由马兜铃酸引起的肾损害在临床上十分常见［2］.急性AAN主要表现为急性肾小管坏死，慢性AAN表现为寡细胞性肾间质纤维化［2-3］，病情多为不可逆性，而且即使停服药物，其肾损害仍然继续进展［4-5］.绝大多数患者很快或逐渐进入终末期肾衰，需要肾脏替代治疗.因此阐明马兜铃酸肾损害的分子机制，以进行早期的诊断和治疗将是缓解马兜铃酸肾损害的关键.为此，我们建立慢性马兜铃酸肾病模型，用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选和比较马兜铃酸诱导的差异蛋白质分子，为马兜铃酸导致肾损害的分子靶点研究奠定基础.1材料和方法1材料雌性Wistar大鼠，20～24wk龄，体质量190～210g；马兜铃酸制剂：用马兜铃酸标准品配制成g/L的溶液,高压灭菌,置冰箱4℃下保存备用.丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、三氨基甲烷、苯甲基磺酰氟；超纯尿素；两性电解质pH5～8；DYYⅢ26型双向电泳槽和梯度混合器；电泳仪.2方法慢性马兜铃酸肾病动物模型的建立根据文献［6］进行，将Wistar大鼠随机分为2组.马兜铃酸组：每只大鼠腹膜内注射马兜铃酸,剂量为5mg/(kg・d)，共16wk.在用药开始后第8，12，16，20，24wk分别处死6只大鼠.正常对照组：每只大鼠腹膜内注射生理盐水2mL/d，共16wk，在第24wk实验结束时处死.大鼠在处死时留取肾脏标本，-70℃冰箱保存，用以作肾脏病理检查.蛋白质样品的准备在用药开始后第12wk处死大鼠，取其肾脏，具体方法为：将大鼠乙醚麻醉，开腹，分离出鼠双侧肾脏，自肾动脉用冰生理盐水在体对肾脏进行灌注直至肾脏发白，取出肾脏用滤纸吸去多余液体，然后用电子天平称质量后，按照比例加入组织裂解液，冰浴上匀浆，静置，离心，用Lowry法测定上清液中总蛋白含量，吸取上清液分装，-70℃冻存.双向电泳首先进行等电聚焦(IEF)：取17cmIPG胶条(pH5～8)在加有样品的泡涨液中以被动式泡涨12～16h，用PROTEANIEFCell等点聚焦仪进行第一向电泳.IEF结束后，IPG胶条置含有DTF的平衡液中；然后进行SDSPAGE电泳：预先制备垂直电泳用凝胶，将进行完IEF并平衡后的胶条转移至凝胶的上方，用10g/L热琼脂糖溶胶封固.在PROTEANIIXi垂直电泳槽的上下槽中加入电极缓冲液后按照预设程序进行电泳，直至溴酚蓝前沿距下缘cm时停止电泳.最后参照BioRad推荐的硝酸银染色方法进行染色.凝胶通过Imagescanner扫描仪以及LabScan扫描软件进行扫描获取图像，利用PDQUEST图像分析软件对电泳结果进行分析，图像分析包括蛋白质斑点的检测、编辑、背景扣除和点的匹配等.统计学处理：所有数据的统计分析在SPSS软件和Excel上进行.2结果慢性马兜铃酸肾病模型的鉴定马兜铃酸组用药后8wk，肾小球、肾小管间质、肾血管均未见损害；用药后12wk，肾小球未见改变，部分肾小管上皮细胞发生空泡变性；用药后16wk，肾脏近曲小管上皮细胞明显肿胀，管腔缩小，并伴有部分肾小管上皮细胞坏死及凋亡；20wk时肿胀的小管上皮细胞逐渐缩小，部分远曲小管出现扩张，个别肾小管萎缩，但未见间质出现纤维化；24wk时可见较多肾小管出现萎缩，肾间质出现多灶性纤维化.马兜铃酸诱导的大鼠肾组织中蛋白质组的差异表达根据马兜铃酸处理后大鼠不同时间肾组织病理改变的结果提示，肾脏于12wk开始出现早期的病变，因此取12wk时的肾组织进行双向电泳.在二维平面上将小鼠肾脏组织蛋白质进行分离，得到2D电泳图谱，正常对照组和马兜铃酸肾病模型组的匹配率为%，有大量蛋白质点相对含量增加或降低，或新出现，其中87个蛋白质点在模型组比正常组上调2倍，18个蛋白质点上调5倍以上，73个蛋白质点下调2倍.部分表达差异的蛋白点数据见表1，其中