大黄、当归多糖对巨噬细胞甘露糖受体作用的研究.docx

大黄、当归多糖对巨噬细胞甘露糖受体作用的研究【摘要】的:探讨当归多糖、大黄多糖与腹腔巨噬细胞甘露糖受体的结合特性及其对腹腔Mφ免疫功能的影响。方法:以异硫氰酸荧光素标记的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA)可特异性的与甘露糖受体相结合为模型,以甘露糖为阳性对照、半乳糖为阴性对照,通过竞争性抑制实验,将APS、RTP分别与腹腔Mφ共同孵育60min后,用荧光显微镜和多功能酶标仪检测腹腔Mφ摄取ManFITCBSA的情况;通过ELISA方法检测APS、RTP刺激Mφ分泌TNFα及IL4的情况。结果:D甘露糖、APS、RTP均可抑制腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA,而D半乳糖则没有此作用;APS、RTP均可诱导腹腔Mφ分泌TNFα,且呈剂量依赖性,甘露糖可完全阻滞RTP诱导Mφ分泌TNFα,对APS诱导Mφ分泌TNFα只有部分对抗作用;两种多糖对IL4的分泌没有统计学意义;甘露糖不能诱导Mφ分泌TNFα与IL4。结论:RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通过甘露糖受体介导,而APS的作用不仅仅与甘露糖受体有关。两种多糖与甘露糖受体的作用差异可能与其单糖组成密切相关。【关键词】巨噬细胞甘露糖受体大黄多糖当归多糖肿瘤坏死因子白细胞介素4许多中药多糖能够刺激巨噬细胞释放前炎症因子或者某些细胞因子,推测其可能机制与Mφ膜上的模式识别受体结合引起细胞内某些信号通路的活化有关。前期研究发现,当归多糖能够促进树突状细胞的成熟,增强抗原提呈能力［1,2］;促进脾细胞IL2、IFNγ的分泌［3］;而RTP能够对抗结肠炎大鼠CD4+T细胞的扩增,降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高,升高结肠炎小鼠降低的IL4水平［4,5］。但是RTP和APS的免疫反应作用机制,尚不清楚。Mφ是体内特定的吞噬细胞和抗原提呈细胞,是连接先天免疫系统及后天免疫系统的桥梁。其表面众多膜受体参与完成这些功能,Mφ甘露糖受体(MacrophageMannosereceptor,MMR)为其中之一。研究表明,MR是一种PRR,可特异性地识别以甘露糖、N乙酰葡糖胺或岩藻糖为末端的配体并与之结合［6］,这些配体可来源于内源性或外源性分子。推测MR在病原体的识别、吞噬与清除,在结核、肿瘤、感染等许多疾病过程中都发挥着重要的作用。我们的研究表明,RTP含有近50%的甘露糖［7］,组分RTP1,RTP2所含单糖比例不同;APS则含有N乙酰葡糖胺残基［1］,组分APS1,APS2,APS3所含单糖比例也不同。这两种多糖的免疫调节作用可能是通过MMR而起效的。本研究将探讨APS混合组分、RTP混合组分对Mφ吞噬及分泌细胞因子的影响,以揭示两种中药多糖的免疫调节作用。1材料和方法材料SD大鼠,由第四军医大学动物实验中心提供,动物分笼饲养于空调温室内,温度22±2℃,相对湿度50%～60%,自动调控昼夜各12h,颗粒饲料喂养,自由饮水。RPMI1640培养基购自Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青公司生物制品厂,PBS缓冲液购自博士德生物工程公司,甘露糖购自上海试剂二厂;半乳糖购自国药集团化学试剂有限公司;APS及RTP由我实验室提供,EDTA以及异硫氰酸荧光素标记的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA)购自Sigma公司;GENiospro多功能酶标仪为瑞士TENCN公司产品;NikonH600L荧光显微镜为日本Nikon公司产品。方法腹腔Mφ的分离、纯化及培养取6只雌性SD大鼠,乙醚麻醉,750mL/L乙醇浸泡1min,取出,消毒腹部皮肤,打开腹壁,但勿伤及腹膜。用注射器向腹腔内注入PBS10mL,轻揉腹腔5min,剪开腹膜,用吸管吸取腹腔内液体,注入离心管,1000r/min离心5min。弃上清,分别加入6mL含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液,吹打混匀后计数,调整细胞密度为1×109个/L,分别接种腹腔Mφ于对应的培养板中,置37℃50mL/LCO2孵箱中培养。3h后轻轻吸弃培养液后,再用PBS洗去未贴壁细胞,重复3次,每孔加入含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液,用姬姆萨瑞氏染色法染色,观察Mφ占95％以上［8］。纯化后的单层大鼠腹腔Mφ用含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养液置于37℃50mL/LCO2孵箱中培养。荧光显微镜观察MFITCBSA与Mφ的结合能力取纯化腹腔Mφ,以每孔1×106个腹腔Mφ接种于底部覆盖玻片的6孔培养板,纯化后分为3组:空白对照组;ManFITCBSA阳性对照组;甘露糖加MFITCBSA实验组。用锡铂纸包严培养板,置37℃50mL/LCO2孵箱中避光孵育60min;用PBS冲洗接种有Mφ的盖玻片3遍,40g/L多聚甲醛固定30min,PBS洗片