地蚕指纹图谱的初步研究.docx

地蚕指纹图谱的初步研究【摘要】目的建立地蚕药材的反相高效液相色谱指纹图谱研究方法。方法高效液相色谱法，LichrospherC18柱，乙腈-%磷酸水梯度洗脱,流速ml/min，检测波长350nm，柱温35℃。结果10批药材共标定了25个共有峰。结论利用地蚕RP-HPLC指纹图谱分析方法较全面地反映地蚕药材的内在质量，可用于地蚕药材的质量控制。【关键词】地蚕指纹图谱地蚕又名肺痨草，为唇形科水苏属植物地蚕Stachysgeobombycis的全草及地下部分，主产于浙江、江西、福建等地。该药味淡，微甘，性平，归肺、肾经，具有益肾润肺、滋阴补血、清热除烦等功能，用于治疗咳嗽、哮喘等［1］，化学研究［2］报道其有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、齐墩果酸等成分。杨中林等［3］以金丝桃苷为对照品高效液相色谱法测定地蚕药材含量。但对地蚕的质量控制方面的研究较少。为了进一步对地蚕药材质量进行科学评价，本实验采用HPLC法对不同产地不同采集时间的地蚕进行指纹图谱的研究，同时进行了系统适应性实验和方法学考察，为地蚕药材的鉴定与质量评价提供依据。1仪器与试药仪器日本岛津LC-20AB高效液相色谱仪(PDA检测器,LC-solution色谱工作站）。试药金丝桃苷对照品(南京青泽医药开发有限公司，含量测定%，批号070415)；地蚕药材经江苏省药品检验所董小平主任药师鉴定；乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司)；冰醋酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)，水经过μm水系滤膜过滤。2方法与结果色谱条件色谱LichrospherC18柱(5μm,mm×250mm)，检测波长为350nm，进样量10μl，柱温35℃，流速ml/min，流动相梯度如表1，记录时间为100min。此条件下对照品金丝桃苷的保留时间min。供试品溶液的制备精密称定粉碎后的地蚕样品约5g，加入75ml甲醇，回流30min，滤过，将药液浓缩至干，用少量水溶解，分别用石油醚和醋酸乙酯依次萃取，醋酸乙酯层浓缩至干，甲醇定容于5ml量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。表1流动相梯度对照品溶液的制备精密称取金丝桃苷对照品1mg，用甲醇溶解，定容于25ml量瓶中(浓度为40μg/ml)，摇匀即得。方法学考察取地蚕样品进行指纹图谱预试验，按上述色谱条件，可得到分离度较好、各峰分布较均匀的指纹图谱，并着重选择了地蚕峰面积较大的13个峰，进行方法学考察。精密度实验精密吸取供试品溶液10μl，按上述色谱条件，连续进样5次，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD均小于%，符合指纹图谱色谱技术要求。稳定性实验取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24h进样检测，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD均小于%，说明供试品溶液在24h内稳定，符合指纹图谱技术要求。重复性实验分别精密称定同一批药物5份，同法制备样品，进样，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD均小于%，符合指纹图谱技术要求。指纹图谱及技术参数［4］指纹图谱选择及特征峰的标定根据10批供试品HPLC图谱，选择7号供试品作为对照指纹图谱。地蚕药材中金丝桃苷为其主要成分，从指纹图谱中可以看出金丝桃苷色谱峰积分面积最大，作为参照峰，同时得到各批次地蚕药材25个共有峰。图1地蚕药材的对照指纹图谱地蚕指纹图谱相似度计算按上述实验方法检测10批地蚕药材的指纹图谱，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版，国家药典委员会)计算10批药材的相似度，结果分别为：，，，，，，，，，。图210批地蚕药材的指纹图谱共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较参照《中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)》［4］，对地蚕药材进行HPLC色谱指纹图谱测定分析，以参照物金丝桃苷(2号峰)的保留时间和峰面积为1，计算10批指纹图谱中25个共有峰的相对保留时间及相对峰峰面积。见表2～3。表210批供试品共有特征指纹峰相对保留时间3讨论样品来源10批地蚕药材均源于唇形科植物地蚕Stachysgeobombycis全草；产地1～4批药材产自浙江省平阳县，5～8批药材产自浙江省雁荡山，9、10批药材产自江苏省徐州市。色谱条件的考察［5］考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸多种流动相系统，其中乙腈-水-冰醋酸系统色谱峰分离度好，故选用。乙腈-水-冰醋酸系统中又考察了%，%，%3种冰醋酸浓度，发现冰醋酸浓度为%时色谱峰分离度最好，故选用。根据二级管阵列检测器检测结果，大部分成分在280nm和350nm时吸收值大，但280nm下干扰强，基线不平稳；350nm下各色谱峰分离好、基线平稳，故采用350nm为检测波长。本实