RNA干扰作用原理及其应用.docx

RNA干扰作用原理及其应用【摘要】RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。【关键词】RNA干扰siRNAdsRNARNA诱导的沉默复合体ArgonauteRNA聚合酶III启动子【Abstract】RNAinterference(RNAi)indiverseorganismsrevealsthesamehighlyconservedmechanismwithanancientisthemodeofsequence-specificpost-transcriptionalgenesilencinginanimalsandplantsinitiatedbyhomologousdouble-strandedRNA(dsRNA).ThediscoveryofRNAiandthemolecularmechanismwillhelpusapplyittostudythegenefunctionandexploitthegenedrug.【Keywords】RNAinterference(RNAi)smallinterferingRNA(siRNA)double-strandedRNA(dsRNA)RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)ArgonautepolIII1背景20多年前，在对矮牵牛进行的研究中有个发现：RichJorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，Jorgensen将这种现象命名为协同抑制。在真菌中也有类似的现象，1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这种现象。当时将这种现象命名为基因表答的阻抑作用(quelling)［1］。通过对转基因植物的研究，发现相应基因的转录并不受影响，将这种现象称为基因转录后沉默。转录后的基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子和RNA病毒的防御机制，可能在植物和动物分化之前就已经出现。1998年华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次将双链dsRNA注入线虫，结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默。将这种由dsRNA引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用［2］。2RNAi的分子机制dsRNA可以介导基因沉默作用，以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点。dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子。哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA)，其一是特异性路径：特殊dsRNA的序列用于RNAi，起始阶段dsRNA被切成siRNA。siRNA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子，能提供一定的信息，允许一个特定的mRNA被降解。siRNA正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，再每条链的3’端都有2个不配对的碱基。图1siRNA另一条是非特异性路径：只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA，抑制所有蛋白质的合成。长的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子，导致翻译抑制。也可以通过激活2’－5’AS合成一个分子激活RNaseL，导致非特异的RNA降解［3］。关于特异性的RNA作用机制模型，包括起始阶段和效应阶段［4］。起始阶段dsRNA在Dicer酶的作用下加工裂解21－23核甘酸长的小分子干扰RNA片断［5］。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。在RNAi的效应阶段，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物，在siRNA解双链即RISC激活过程需一个ATP［5］。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合，随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达。RISC由多种蛋白成分组成，包括核酸酶，解旋酶和同源RNA链搜索活性等。最新研究表明，Argonaute蛋白为RISC的特有成分，被比喻成“切薄片的机器”。Argonaute有一个月牙型的底座由三部分组成，分别为N-端、中部和PIWI区域。在月牙底座上面有一个PAZ部分，由茎杆结构支撑。Argonature蛋白有一个明显的凹槽贯穿整个蛋白，凹槽内壁带正电有利于与RNA带负电的磷酸骨架结合。siRNA解旋后，siRNA单链的3’端伸入PAZ的裂缝中，整个单链沿着PAZ伸展开，同时目的片段mRNA结合于新月