嗅黏膜嗅鞘细胞的实验研究概述.docx

嗅黏膜嗅鞘细胞的实验研究概述【关键词】嗅鞘细胞嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)在功能上是介于施万细胞和少突胶质细胞之间的一种特殊的胶质细胞,具有神经营养、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等，为轴突生长提供了适宜的微环境及较强的迁移的特性，使其成为促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。嗅鞘细胞同胶质细胞、施万细胞在表现型上有共同点，它们都能促进轴突的再生，主要区别在于嗅鞘细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于外周神经中。嗅黏膜中的神经元是唯一的生后才生长并在成年时继续分化的神经元，寿为4～12周，随着新细胞的生长，又建立了新的神经支配关系。嗅鞘细胞存在于嗅神经及嗅球的神经层上，沿嗅神经的全长，从周围神经系统到中枢神经分布。成年哺乳类嗅黏膜中的嗅觉神经元具有终生更新的特点,由此说明嗅黏膜中存在神经干细胞。嗅黏膜由源于外胚层的嗅板及位于其底部的间充质发育、分化而来,由上皮和固有层组成。上皮内的嗅细胞是初级嗅觉神经元,成体嗅黏膜内的嗅细胞终生处于不断凋亡、更新之中,新生嗅细胞的轴突进入固有层由嗅鞘细胞包绕形成嗅神经,经筛孔进入嗅球与僧帽细胞形成突触,在轴突的生长和突触的重建过程中,嗅鞘细胞具有重要的诱导作用［1～3］。1嗅鞘细胞的研究现状嗅鞘细胞从被发现到体外培养成功,再到能够用于动物实验研究及应用于临床研究,经历了漫长的时间。Devon和Doucete［4］于1992年首次证实嗅鞘细胞可在体外培养条件下形成髓鞘。嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤是近10年发展起来的。Li等［5］报道嗅鞘细胞移植到受损的成年大鼠皮质脊髓束可以促进轴突再生,脊髓功能得以改善。2000年Barnet［6］首次报道用术中切除的嗅球在体外培养并扩增人类嗅鞘细胞,并证明这些细胞生理功能良好,植入啮齿动物脱髓鞘区域能髓鞘化轴突,且无致瘤性。近年从嗅黏膜中提取、纯化培养嗅鞘细胞，以其独特优势和临床应用价值，越来越受到重视。2嗅鞘细胞的实验取材方法成年SD大鼠体重250～300g,腹腔麻醉后,消毒面部皮肤。经一侧鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨,暴露鼻中隔黏膜,用虹膜枪和眼科剪分离、剪取鼻中隔后三分之一嗅黏膜。可见鼻中隔最后上部的嗅区,呈黄色与呼吸道黏膜有较明显的区别。将此嗅区鼻中隔(嗅黏膜和骨质)完整取下,在显微镜下将两侧的嗅黏膜自骨片上完整刮下,立即放入冰的DMEM抗生素液中(青霉素和链霉素各100IU/L)。有学者从后鼻孔和直接开颅进入鼻中隔，分离嗅黏膜。3嗅黏膜细胞的体外培养嗅黏膜取出后用F12培养基漂洗3次去除血迹后移至%胰酶中,用眼科剪充分剪碎并用吸管吹打,制成嗅黏膜混合细胞悬液,用培养基终止消化,离心、清洗去除胰酶，用含10%胎牛血清的F12培养基将细胞浓度调至1×106/ml,接种于无包被的玻璃培养皿,置CO2培养箱内(37℃,5%CO2)培养。每2～3天换液一次。当将离体嗅黏膜制成细胞悬液后,细胞之间的平衡即被打破,接触抑制及反馈调节机制亦被解除。细胞悬液中的神经干细胞在其他细胞分泌的细胞因子和细胞外基质的作用下,将进入细胞分裂、增殖周期。整个培养过程,更换培养液也十分关键。嗅黏膜OECs贴壁生长时间较晚,一般在培养第5～6天才开始,不像嗅球OECs24h后就大量贴壁生长。所以在这段时间内换液应十分小心,尽量不要晃动培养液,以保持细胞沉淀,根据情况最好行1/3量换液或根据培养液的颜色添加培养液,以免丢失细胞。纯化：按改良Nash差速贴壁法在培养36～48h后,将培养液吸出,重新种植于包被多聚右旋赖氨酸的24孔细胞培养板内,进行纯化培养。纯化培养液中可加入20μmol/L的Forskolin和20μg/ml的BPE(bovinepituitaryextract)以促进细胞的生长培养14天,其间观察细胞生长情况,间或摄片。成纤维细胞的生长可机械刮除亦可用5μmol/LArac处理24h来控制。Arac对OECS的生长也有抑制作用，故有学者也不主张使用。是否纯化的观点：有部分学者认为根据嗅黏膜细胞的社会学特性,即各种细胞之间存在着相互依存、相互诱导、相互制约的调节机制。嗅黏膜神经干细胞和嗅鞘细胞体外培养时,不宜过早地纯化细胞,混合细胞培养更有利于各细胞成分的分裂、增殖尤其是有利于神经干细胞克隆球的形成。Shou等［7］将嗅上皮细胞与其基底细胞共培养发现,后者能促进神经前体细胞的增生,其实验结果从另一侧面证明了上述观点。4嗅黏膜细胞的免疫细胞化学染色目前常用的染色方法主要有：Nestin染色、NSE染色、GFAP及p75NGFR染色等，体外培养的时间不同，免疫反应阳性细胞形态亦不相同，成熟的嗅鞘细胞大多为梭形双极细胞,突起细长,其走向具有明显的方向性,细胞排列成束。5原代培养嗅黏膜细胞的生长特点嗅黏膜细胞接种于培养皿24h内除