楮头红多糖的分离纯化与生物活性检验.docx

楮头红多糖的分离纯化与生物活性检验【摘要】目的从药用植物楮头红中分离纯化多糖成分并验证其生物活性。方法用热水提取，乙醇沉淀提取粗多糖，再经Sevag法去除蛋白，透析去除小分子物质，冷冻干燥得楮头红多糖粗品；采用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-200凝胶柱层析进行分离纯化；用TBA法考察多糖的抗脂质过氧化作用；采用CCl4急性肝损伤模型，测定其血清中AST变化。结论获得一个楮头红多糖组分。TBA法表明该组分对小鼠自发性脂质过氧化具有显着的抑制作用；在保肝试验中，给药组能明显抑制AST的升高，对肝损伤有一定的保护作用。【关键词】楮头红多糖；分离；纯化；生物活性crudeproductofS.nepalensisWallpolysaccharidewaspreparedwithhotwaterextraction,ethanolprecipitation,dialyzation,andcrudepolysaccharidewasseparatedbyDEAE-cellulosechromatographyandpurifiedbySephadexG-200inhibiteffectofthepolysaccharideonlipidperoxidationofmiceliverwasconductedbyTBAmodelofliver-injuryinducedbycarbontetrachloride，别名风柜斗草。《中药大辞典》记载：其性凉、味酸、无毒；功用：清肺热，去肝炎；《实用中草药》记载：其性平、味甘。功用：清热解毒、凉血利水。主治急性肝炎，肺热咳嗽。据有关临床使用报道：楮头红对急性肝炎疗效最佳，对慢性肝炎及乙肝病毒携带者有效［1，2］。楮头红已在福建省民间广为使用，是一种极有价值的天然中草药资源。前期研究表明，楮头红中含有游离苷类物质、黄酮类物质、酚类、鞣质类等物质，含量较高的多糖和较丰富的人体所必需的营养元素［3］。为了进一步研究楮头红的生理药理作用，在前期研究基础上，我们对楮头红多糖进行了分离纯化，对获得组分的生物活性进行了初步验证。1材料与方法仪器电子天平，恒温水浴锅，低速大容量离心机，1600分光光度计，RE-52A旋转蒸发仪，MC99-3自动液相色谱分离层析仪，Agilent1100高效液相色谱仪。材料与试剂楮头红；DEAE-52填料、sephadexG-200填料、透析袋、联苯双酯滴丸；石油醚、95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、98%浓硫酸、氯仿、氯化钠、氢氧化钠、正丁醇等，均为分析纯。楮头红粗多糖的提取楮头红多糖的提取［4，5］楮头红全草用蒸馏水洗涤去土，40℃低温干燥、粉碎。称取草药250g,用石油醚80℃回流脱脂2次，之后用95%乙醇除小分子单糖，滤渣挥去酒精，晾干后于90℃回流提取3次，每次2h，合并滤液，离心去除不溶物。滤液加%的活性炭60℃保温30min，不断搅拌脱色，过滤，取上清液放入-40℃冰箱过夜，第二天取出自然融化后离心去除不溶物。上清液浓缩适当的体积后缓缓加入5倍量的95%乙醇沉淀，过滤，沉淀依次用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复3次。除蛋白［9］用Sevag法脱蛋白，氯仿正丁醇4：1，多糖溶液和混合液的体积比为3：1，混合搅拌20～30min，充分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀。透析干燥多糖复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液体积比为1：20，4h换一次水。将透析液进行冷冻干燥后即得粗多糖。楮头红粗多糖的纯化分离［6～13］DEAE-52柱层析DEAE-52填料依次用/LNaOH、/LHCl、/LNaOH处理，再以蒸馏水洗至中性后装柱。装柱后用蒸馏水平衡48h。将粗多糖溶于少量重蒸水，过柱，上样量为交换容量的10%～20%。用水、/LNaCl、/LNaCl梯度洗脱，用自动部分收集器每15min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测各主峰组分，将各主峰位分别收集合并，蒸馏水透析2天，冷冻干燥得楮头红多糖。SephadexG-200柱层析将SephadexG-200填料加适量蒸馏水浸泡12h，100℃煮沸4h，脱气后装柱，用/LNaCl平衡48h。将中收集的各主峰组分进一步纯化，用/LNaCI洗脱，自动部分收集器每30min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测。收集各主峰组分，冷冻干燥。HPLC纯度验证将多糖溶解成合适浓度，过μm的滤膜后进样，进样体积20μl，流速/min，示差检测器检测，柱温箱温度35℃。多糖的生物活性验证小鼠肝自发性脂质过氧化实验［14］小白鼠禁食18h，引颈法处死，迅速取出肝脏，用4℃下预冷的/LPBS洗去表面残血，滤纸吸干。用玻璃匀浆器将肝脏制成10%的肝匀浆。取该匀浆1ml，加不同浓度的多糖溶液600