Lipstatin高产菌株筛选.docx

Lipstatin高产菌株筛选【摘要】以毒三素链霉菌XC-lp-2的变株OT-3为出发菌株，经UV和微波复合诱变处理，并在含豆油的平板上定向筛选耐豆油突变株，获得了高产突变株XC-lp-69，其lipstatin发酵效价达到911μg/ml，较出发菌株OT-3提高了%。传代试验表明突变株XC-lp-69的高产遗传特性稳定。【关键词】Lipstatin；菌种选育；诱变；毒三素链霉菌ABSTRACTAfterStretomycestoxytriciniOT-3wastreatedbyUVandmicrowaveirradiation,thesoybeanoiltolerantmutantswerescreenedandahigh-titrestrainXC-lp-69wasobtained.TheproductivityofstrainXC-lp-69reached911μg/ml,whichis%morethanthatofthestartingstainOT-3.ThesubcultureexperimentsindicatedthatthehereditarycharacterofhighproductivityofstrainXC-lp-69isstable.KEYWORDSLipstatin;Strainbreeding;Inducedmutation;Streptomycestoxytricini收稿日期：2006-11-29作者简介：韩俊茹，女，生于1966年，女，硕士。研究方向：生物制药。Lipstatin(利普司他汀)是毒三素链霉菌(Stretomycestoxytricini)的代谢产物，能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收，其四氢衍生物奥利司他(orlistat)已被Roche公司开发为减肥药(商品名：赛尼可，Xenical)［1，2］，是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用上市的治疗肥胖症的药物［3］。因此，发酵法生产lipstatin备受关注。提高lipstatin的发酵生产水平主要依赖于菌种选育和发酵工艺(培养基和培养条件)的优化这两个相辅相成的环节。本文采用紫外线照射和微波交替处理，并结合豆油耐受性菌株的理性化筛选，选育lipstatin高产菌株，获得了高产突变株XC-lp-69，发酵水平较原始菌株(XC-lp-2)提高了2倍多，且该菌株经多次传代后高产特性稳定性较好。1材料与方法菌种毒三素链霉菌(Stretomycestoxytricini)XC-lp-2由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供，发酵效价300μg/ml左右。培养基(1)斜面及分离平板培养基(g/L)可溶性淀粉，蛋白胨，KNO3，NaCl，KH2PO4，琼脂，去离子水配制，～。(2)摇瓶种子培养基(g/L)冷榨黄豆饼粉，甘油，酵母膏，豆油，KNO3，MgSO4·7H2O，自来水配制，～。(3)发酵培养基(g/L)冷榨黄豆饼粉，甘油，大豆卵磷脂，酵母粉，豆油，自来水配制，～。培养条件(1)斜面培养条件培养温度(30±)℃，相对湿度35%～50%，培养时间120～150h。(2)种子培养条件培养温度27℃，250ml三角瓶装量25ml，转速240r/min，培养时间20～24h。(3)发酵培养条件培养温度27℃，250ml三角瓶装量25ml，转速240r/min，培养时间120h。诱变处理(1)紫外线照射将单孢子悬浮液置紫外诱变箱(紫外灯功率30W，波长253nm照射垂直距离30cm)中诱变处理一定时间，用黑布包好，在红灯下用无菌水做梯度稀释后涂布平板，30℃避光培养5～6d，挑单菌落传斜面。(2)微波处理将单孢子悬浮液置于灭菌10ml试管中，在500ml烧杯中冰浴；然后将冰浴烧杯连同试管放入800W的微波炉中，功率开至中档，照射一定时间，经梯度稀释后涂布平板，30℃培养5～6d，待菌落成熟后挑单菌落传斜面。耐豆油突变株筛选将经过UV照射、微波处理或两者交替处理后得到的孢子悬液梯度稀释后，分别涂布于含一定豆油浓度的分离平板上，30℃培养。分析方法(1)Lipstatin发酵效价测定试样制备取发酵液10ml，4000r/min离心15min，上清液用丙酮1∶4的比例稀释摇匀浸泡1h，取上清液再次10000r/min离心3min或膜过滤，取清液进行HPLC测定胞外效价，并用同样的方法测定菌丝体沉淀中的产物量(胞内效价)。本文中发酵效价为胞内外效价之和。HPLC色谱条件色谱柱C18ODS(×250mm，5μm)，柱温35℃，检测器DAD(HP1100)，检测波长210nm，流动相为乙腈∶水(86∶14)，流速/min。(2)pH测定用酸度计测定。(3)菌丝浓度测定取10ml发酵液，4000r/min离心15min，测定沉淀物在发