戊四氮点燃癫痫大鼠学习记忆改变及海马神经颗粒素的表达变化.docx

戊四氮点燃癫痫大鼠学习记忆改变及海马神经颗粒素的表达变化【摘要】目的：探讨戊四氮慢性点燃癫痫对大鼠学习记忆能力的影响及海马神经颗粒素的表达变化.方法:采用戊四氮腹腔注射慢性点燃癫痫(chronicepileptic，CEP)模型，用Morris水迷宫和Y迷宫对大鼠进行学习记忆能力检测,运用反转录多聚酶链反应(RTPCR)方法和WesternBlot方法分别测定大鼠海马NgmRNA和蛋白的水平变化.结果:与对照组比较，慢性癫痫发作组大鼠在水迷宫中的逃避潜伏期［(±)svs(±)s］延长()，穿越平台次数［(±)vs(±)］减少()，在Y迷宫中的错误反应次数［(±)vs(±)］增多()，并伴有海马NgmRNA转录水平［(±)vs(±)］下降()和蛋白表达［(±)vs(±)］减少().结论:戊四氮慢性点燃癫痫大鼠学习记忆能力受损，海马NgmRNA转录水平下降和蛋白表达减少可能参与了这一过程.【关键词】点燃效应癫痫学习记忆神经颗粒素0引言癫痫患者除癫痫发作外，常伴有注意力分散、学习记忆能力减退等认知功能受损的表现，极大的影响了患者的生活质量［1］.癫痫患者的认知功能障碍已成为癫痫防治的重点之一，但其具体机制不明.Ng是一种新发现的、由78个氨基酸组成的一种脑特异性蛋白质.Ng作为钙调蛋白(calmodulin,CaM)的储库及蛋白激酶C(ProteinkinaseC,PKC)的作用底物，在学习记忆、突触可塑性、应激及老龄化等方面均发挥了重要作用.海马是与学习记忆密切相关的重要脑区.本研究建立了更加类似临床反复痫性发作的慢性癫痫大鼠模型，观察其学习记忆能力变化和海马Ng的表达情况，以探讨癫痫后学习记忆障碍的分子机制.1材料和方法材料实验动物清洁级雄性SpragueDawley(SD)大鼠,由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)20031003，实验起始体质量(200±20)g，12h光亮/黑暗条件、22℃～25℃环境温度，分笼喂养.药品、试剂与仪器PTZ(Sigma公司)，兔抗Ng多克隆抗体(Upstate公司)，羊抗兔IgG荧光抗体(Rockland公司)，BCA蛋白定量试剂盒(Novagen)，Trizol(Invitrogen)，RtPCR反转录及扩增试剂(Promega公司)，引物，WesternBlot远红外荧光扫描成像系统(Odyssey)，PCR仪(Eppendorf)，凝胶扫描分析系统.方法动物分组及模型制备经两次交替电刺激Y迷宫试验筛选后获得合格动物64只，随机分为两组：慢性癫痫发作组(chronicepilepticgroup，CEP）32只，正常对照组(normalcontrolgroup，NC）32只.CEP组大鼠每日晨8∶00~9∶00腹腔注射PTZ35mg/kg，连续30d，每天注射完毕后观察1h.NC组大鼠给予同等剂量、同等次数的生理盐水.依据Racine分级标准［2］将大鼠行为分为6级.完全点燃的标准是获得连续3次Ⅳ级或以上的运动惊厥.水迷宫和Y迷宫测定大鼠学习记忆能力实验第31天起行水迷宫和Y迷宫检测.Morris水迷宫实验包括：(1)定位航行实验:实验历时4d，第一天大鼠在水池内自由游泳2min，熟悉环境.以后每天上下午各测试一组次，每组次每只大鼠从四个象限各入水1次，记录逃避潜伏期.如120s未找到平台，将大鼠引上平台休息30s，记录潜伏期为120s.(2)空间探索实验:用于测试大鼠的空间记忆能力.定位航行实验完毕的第二天，将平台撤除，选平台相对象限为入水点，记录大鼠在120s内穿越平台区域的次数及在平台象限的游泳时间.Y迷宫试验：试验分为两天，第一天为训练阶段，首先将大鼠放入迷宫，适应环境5min，然后将大鼠放于某一臂作为起步区进行电击，其一次性逃至安全区为正确反应，否则为错误反应.每次测试间隔30s，依次重复，直至学会为止.学会的标准为连续10次电击有9次正确反应.第二天为保持阶段，不再适应环境5min，每只大鼠进行30次测试，记录错误反应次数，每次测试大鼠到达安全区所需时间以及全天总反应时间.全天总反应时间指全天30次测试所需的总时间.PCR方法检测大鼠海马NgmRNA的变化两组大鼠各取8只，迅速分离海马，Trizol提取海马总RNA，测定其浓度及纯度.每个样品取2μgRNA反转录合成cDNA，再各取1μLcDNA进行PCR扩增.引物序列：Ng上游：5′CCACATGGCGAGGAAGAAGA3′，下游：5′CTCCTGAAGCTGGCTGGTTG3′，扩增长度244bp.βactin上游：5′GCCATGTACGTAGCCATCCA3′，下游：5′GAACCGCTCATTGCCGATAG3′，扩增长度为375bp.引物由北京赛百盛基因技术有限公