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RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制【摘要】目的：应用RNA干扰技术研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.方法：分别构建针对NP，PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP，pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA，转染MDCK后，H5N1亚型流感病毒感染细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值，观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力.结果：荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达%.蛋白质印迹结果表明，重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达，两者的抑制率分别为%和%.半定量RTPCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为%；pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为%；pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率，分别为%和%.而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用.HA结果表明，三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖，以pEGFP6/NP+PA的作用最为显着，它们抑制流感病毒增殖的能力分别为%，%和%.结论：NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达，并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.【关键词】RNA干扰；正粘病毒科；MDCK细胞株；NP基因；PA基因0引言近来，禽流感在世界各地频繁爆发，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失［1］，也严重威胁到人类的健康［2］.高致病性的H5N1亚型是较为严重的一类［3］.而现有的、针对HA和NA的流感疫苗在流感病毒新亚型出现时却无能为力［4］.我们利用RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)［5］，选择在A型流感病毒复制过程中起重要作用的RNA聚合酶PA或/和核蛋白(nucleoprotein，NP)编码基因中的高度保守序列作为siRNA靶序列，将其分别或同时克隆入表达载体，在马丁达比狗肾细胞中，观察诱导PA或NP基因沉寂情况，以期具有更高的抑制效能，为预防与治疗流感寻找一种有效的措施.1材料和方法材料pEGFP和pGenesil1载体由武汉晶赛生物技术有限公司提供.限制性核酸内切酶购自NEB公司.连接酶、DNAMarker由Takara公司提供.转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen.兔抗人NP抗体购于晶美生物工程有限公司，βactinmAb及HRP聚合的羊抗兔IgG购自Sigma公司.方法选用流感病毒A/Pheasant/Shantou/44/2004(H5N1亚型，分离).将病毒接种于10d鸡胚尿囊腔中，置于37℃的孵箱中，于病毒接种后的48h收获尿囊液，冻融、离心后分装贮存于-70℃备用.测定其空斑形成单位及感染复数.据文献［6］，结合siRNA序列设计原则，确定PA2087和NP1496各19个单核苷酸作RNA干扰靶序列.正义链：5＇gatccggatcttatttcttcggagttcaagacgctccgaagaaataagatccttttttgaattca3＇，反义链：3＇gcctagaataaagaagcctcaagttctgcgaggcttctttattctaggaaaaaacttaagttcga5＇;PA2087，正义链：5＇gatccgcaattgaggagtgcctgattcaagacgtcaggcactcctcaattgcttttttgagctca3＇，反义链：3＇gcgttaactcctcacggactaagttctgcagtccgtgaggagttaacgaaaaaactcgagttcga5＇，上述两序列的5＇端和3＇端分别引入BamHI和HindIII的酶切序列，也在HindIII位点内侧分别引入EcoRI和SacI的酶切位点，以便将两个RNA干扰序列以串连的方式克隆入同一个载体中的两个U6启动子后，即U6promoterNPU6promoterPA，这样可同时产生两个RNA干扰序列.等量的正反义寡核苷酸混合、退火后分别插入经BamHI和HindIII线性化的载体pEGFP和pGenesil1中，得到重组载体pEGFP/NP和pGenesil/PA.两载体经SacI和SalI双酶切后，分别回收载体与片段并连接，构建成新的重组子pEGFP/NP＋PA.实验中为了排除siRNA本身的影响，设计了一个与流感病毒基因组序列无关的HK序列作为对照，寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.MDCK细胞株常规培养