短暂性MCAO大鼠注射天麻素具有神经保护作用.docx

短暂性MCAO大鼠注射天麻素具有神经保护作用【摘要】目的：探讨天麻素对缺血性脑损伤的神经保护作用.方法：通过线栓技术闭塞大脑中动脉2h诱导建立暂时性局部脑缺血模型，SD大鼠腹腔内连续注射天麻素3d.采用TUNEL染色测定缺血边缘区细胞凋亡；免疫组织化学染色观测S100β和iNOS蛋白表达.结果：MCAO后3d，天麻素组大鼠脑梗死边缘区TUNAL+细胞数目明显减少；S100β和iNOS+细胞数目下降.结论：天麻素可以抑制脑缺血诱导的细胞凋亡，具有神经保护作用；S100β和iNOS蛋白表达的下调可能涉及到天麻素的抗细胞凋亡作用.【关键词】天麻素；脑缺血；细胞凋亡；S100β；iNOS0引言脑血管疾病的病理生理过程是非常复杂的，涉及到兴奋性毒性、一氧化氮(NO)蓄积、钙超载、氧自由基损伤、能量代谢障碍、凋亡、胶质细胞异常等.脑缺血后神经元死亡存在坏死和凋亡两种方式.抑制凋亡过程，挽救缺血性半暗带内的神经元，防止半暗区向梗塞区的发展逐渐成为脑缺血保护剂研究的热点［1］.研究发现天麻素的神经保护作用与抑制细胞凋亡有关［2］.本实验的目的是通过研究天麻素对暂时性大脑中动脉闭塞大鼠的细胞凋亡和S100β以及iNOS蛋白表达的影响，探讨天麻素的神经保护作用机制.1材料和方法材料健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠，体质量240～280g.实验前常规环境分笼饲养7d.参考longa等(1989)描述的管腔内线栓技术闭塞大脑中动脉制作暂时性局部脑缺血.简要过程,大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉，分离暴露右侧颈部血管，40缝合线结扎颈外动脉和颈总动脉，将一头端加热呈光滑球形并覆有多聚赖氨酸的30单股尼龙线缓慢插入颈内动脉至感到有轻微阻力为止(约距颈总动脉分叉处17～18mm),闭塞MCA起始部.手术期间使用电热毯维持大鼠体温在～℃.大鼠拔线后分为天麻素组和对照组.天麻素组大鼠按100mg/kg腹腔内每日注射天麻素注射液1次，连续3d.对照组大鼠注射同体积的生理盐水.所有大鼠放回笼中常规喂养.方法神经学的评价大鼠MACO后2h参照Bederson等(1986)方法进行神经功能损伤程度的评定.即0级:行为正常；1级:提尾悬空左侧前肢屈曲，肩内收；2级：抵抗对侧推力下降，伴前肢屈曲；3级:自发性侧向旋转或运动，伴抵抗对侧推力下降和前肢屈曲.将评定为3级的大鼠视为成功MCAO模型，用于后续实验.成功MCAO模型大鼠经水合氯醛麻醉后，轻轻抽出尼龙线，建立MCA再循环.和免疫组织化学染色及分析天麻素组和对照组大鼠于MCAO后3d水合氯醛深麻，常规灌注、取脑、固定、石蜡包埋，冠状位切片，片厚6μm，用于TUNEL染色、S100β和iNOS免疫组织化学染色.细胞计数每只大鼠各取4张TUNEL,S100β和iNOS染色切片，通过MoticImagesAdvanceed图像分析系统，使用×20物镜在缺血边缘区选取4个(640×480像素)等面积视野区，计数TUNEL,S100β和iNOS阳性细胞.统计学处理：计量数据均用x±s表示，两组间比较采用t检验，为有统计学差异.2结果缺血边缘区TNNEL阳性细胞的形态和数目变化MCAO后3d在缺血侧半球可见许多TUNEL阳性细胞环绕在梗死区周围，散在分布于正常细胞中.而天麻素组缺血边缘区凋亡细胞数目(±)较对照组减少(P0.05).图1MCAO大鼠和天麻素治疗MCAO大鼠缺血边缘区TUNEL免疫反应阳性细胞TUNEL×200缺血边缘区S100β阳性细胞的形态和数目变化免疫组织化学染色显示，对照组大鼠MCAO后3dS100β阳性细胞在缺血中心区消失，在缺血边缘区出现大量胞体肥大呈圆形的S100β阳性细胞，突起较多且长.天麻素治疗组大鼠在缺血边缘区也可见许多的S100β阳性细胞，但数目较少.S100β阳性细胞定量分析显示对照组组为±，天麻素组为±，天麻素组少于对照组，差异有统计学意义(P0.05).图2MCAO大鼠和天麻素治疗MCAO大鼠缺血边缘区S100β免疫反应阳性细胞SABC×200缺血边缘区iNOS阳性细胞的分布和数目变化免疫组织化学染色显示，各组大鼠MCAO后3d在缺血侧脑可见许多iNOS阳性细胞，主要集中于梗死区周围.在天麻素组iNOS阳性细胞体积较小,数目(±)较对照组减少().图3MCAO大鼠和天麻素治疗MCAO大鼠缺血边缘区iNOS免疫反应阳性细胞SABC×2003讨论研究表明脑缺血再灌注后的病理改变是形成缺血核心区和缺血半暗带.核心区为脑血流减少最严重的区域，神经元和胶质细胞能量衰竭，失去调节其离子含量的能力，最终细胞死亡.围绕在缺血核心周围的缺血半暗带血供受抑制,细胞功能受损，但能量代谢保存，为可逆性修复的脑组织［1］.脑缺血再灌注后,坏死细胞主要位于梗死灶中心区,而凋亡细胞主要分布于梗死边缘区的内