当归补血汤对荷瘤小鼠化疗后免疫功能的影响.docx

当归补血汤对荷瘤小鼠化疗后免疫功能的影响【摘要】目的观察当归补血汤对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法建立S180荷瘤小鼠模型后，随机分为4组，荷瘤对照组、CTX组、当归补血汤＋CTX组及当归补血汤组。造模次日开始给药，共10d，停药次日处死，测定脾脏和胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性、T淋巴细胞增殖能力。结果当归补血汤可提高化疗荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性，同时还对刀豆素A诱导的T淋巴细胞增殖有促进作用。结论当归补血汤具有提高机体免疫功能，抵御化疗所引起的免疫功能下降的作用。【关键词】当归补血汤；肿瘤；免疫功能；化疗当归补血汤方出自李东垣《内外伤辩惑论·暑伤胃气论》，为气血双补之经典名方。研究表明，此方具有增强免疫的效果［1］。但有关当归补血汤对化疗荷瘤小鼠免疫系统的影响报道较少，我们通过建立S180荷瘤小鼠模型，观察了当归补血汤对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响，旨在为该方的提供一定实验依据。1材料与仪器动物及细胞株清洁级昆明小鼠，7～9周龄，雌雄各半，体质量18～22g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证：SCXK(冀)2003-1-003。动物在实验前适应性驯养1周。饲料和垫料由河北医科大学实验动物中心提供。实验期间自由采食饮水。腹水型S180瘤株由河北医科大学实验动物中心提供，L929细胞株由北京市中医研究所提供。药品当归补血汤由黄芪和当归组成，将上述药物加水浸泡20min后，煎煮3次，约30min/次，3煎溶液混合过滤，取汁300ml，离心取上清，80℃水浴浓缩至每毫升含生药，分装，高温消毒后置于4℃冰箱保存备用。化疗药物：注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司(批号：06112021)。试剂及仪器DMSO(Amresco公司产品)，四氮甲唑蓝(MTT，Amresco公司产品)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司产品)，RPMI-1640完全培养基(Amresco公司产品)。酶标分析仪，CO2培养箱，超净台(苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司产品)，倒置显微镜。2方法动物模型的建立［2］无菌条件下抽取6～7d生长良好的S180小鼠的腹水，按1∶3比例用生理盐水稀释，反复冲打，充分混匀，在显微镜下计数，用生理盐水调整细胞浓度为×107/ml，取于每只小鼠右侧腋窝下碘酊消毒后皮下接种。瘤株接种前，均用%台盼蓝染色，计算活细胞数为95%～98%。从抽取腹水时开始，到移植完最后1只小鼠的总时间控制在1h内。分组及给药小鼠接种24h后按体质量和性别随机分成荷瘤对照组、CTX组、当归补血汤+CTX组和当归补血汤组。荷瘤对照组均用生理盐水灌胃，同时腹腔注射生理盐水，单纯化疗组腹腔注射CTXg·kg-1·d-1，同时用生理盐水灌胃，当归补血汤+CTX组腹腔注射CTXg·kg-1·d-1，同时用当归补血汤12g·kg-1·d-1灌胃，当归补血汤组用当归补血汤12g·kg-1·d-1灌胃，同时腹腔注射生理盐水，各组灌胃容积均为ml/只，腹腔注射容积均为ml/只，各组于瘤细胞接种第2日开始用药，1次/d，连续10d。脾脏、胸腺指数小鼠脱臼处死，以无菌操作取下脾脏、胸腺，电子天平称质量并计算脏器指数。腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定［3］小鼠脱臼处死，75%酒精中浸泡2min，置超净台。每只小鼠腹腔注射冷PBS液10ml，轻揉腹部2min，回抽腹腔液，离心弃上清。RPM1－1640培养液洗两次，计数并调节细胞浓度为2×106个/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，每样本均设3个复孔。37℃，5%CO2培养箱培养4h，温PBS液洗并吸出未贴壁细胞，得到巨噬细胞单层。于每孔中加入%的中性红溶液100μl，置CO2培养箱培养1h，用温PBS液反复冲洗未被吞噬的中性红3次。于每孔中加入细胞裂解液（1∶1的冰醋酸和无水乙醇)100μl，4℃静置过夜，用酶标仪在570nm处测定OD值。NK细胞活性测定［4］无菌摘取脾脏，按常规制备脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI－1640培养液配成1×107/ml浓度作为效应细胞。取传代培养的L929细胞，用%胰酶消化液消化2min，加入完全RPMI－1640培养液，调细胞浓度为2×105/ml作为靶细胞，在96孔平底板上每孔加入靶细胞悬液100μl，37℃，5%CO2培养90min，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔加入100μl效应细胞悬液，做4个复孔，靶细胞对照孔加完全RPMI－1640培养液100μl；然后将96孔板放在37℃，5%CO2孵箱中孵育20h，