枸杞RAPD反应体系的建立与优化.docx

枸杞RAPD反应体系的建立与优化【摘要】目的探索枸杞RAPD反应体系并对其进行优化。方法在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上，根据RAPD扩增效果确定枸杞基因组DNA的最佳RAPD反应体系。结果建立了适合枸杞的RAPD反应体系：20μl体系中含1×PCRbuffer，50ng模板，μM10碱基随机引物、1UTaqDNA聚合酶、2mMMg2+，125μMdNTPs。结论枸杞的RAPD反应体系能够用于枸杞的RAPD分析。【关键词】枸杞；RAPD；反应体系EstablishmentandOptimizationofRAPDReactionSysteminLyciumbarbarumAbstract：ObjectiveTostudytheRAPDreactionsysteminLyciumbarbarumL.andoptimizationofit.MethodsBasedontheRAPDreactionsystemwasoftenusedinourlab,RAPDreactionsystemwastestedbytheresultofRAPD.ResultsAnRAPDreactionsystemsuitableforLyciumbarbarumL.wasestablished,thatwas,20μlamplificationcontaining1×PCRbuffer,50ngtemplateDNA,μmprimer,1UTaqDNApolymerase,2mmol/LMg2+,125μmol/LdNTPs.ConclusionTheRAPDreactionsystemcanbeusedtoRAPDanalysisinLyciumbarbarum.Keywords：Lyciumbarbarum；RAPD；ReactionsystemRAPD由Williams和Welsh两个研究小组几乎同时于1990年建立起来的一项分子标记技术［1，2］，是目前中药研究者最常使用的DNA标记技术，但RAPD易受各种因素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种各有不同，因此在对枸杞进行RAPD分析时，完全有必要对各因子的反应条件进行优化，建立稳定的、最佳的反应体系。本研究力图通过实验建立一种适合枸杞的RAPD反应体系。1材料与方法材料实验所用的材料为枸杞道地品种宁夏枸杞的主栽品种宁杞1号，采自宁夏农业生物技术重点实验室试验地。仪器与试剂PCR仪；电泳仪；电泳槽；SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪；Eppendorf5415D离心机；UVPGDS-8000凝胶成像系统。Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、300bpDNAladder购自北京天为时代公司，10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose，EB。方法枸杞基因组DNA提取枸杞基因组DNA提取根据严奉坤等［3］的提取法进行。PCR扩增及电泳检测反应在PTC-200型PCR仪上进行。初始扩增条件采用本实验室长期使用的20μl反应体系，其成分为：10×Buffer加μl25mmol/LMg2+，1μlmmol/LdNTPs，1UTaqDNA聚合酶，1μlμmol/L10碱基随机引物，50ng模板。反应程序：预变性94℃2min；预扩增程序：94℃20s，36℃30s，72℃1min，5个循环；扩增程序：94℃20s，40℃30s，72℃1min，40个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保存。扩增产物经含有μg/mlEB的%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结束后在UVPGDS-8000凝胶成像系统上观察照相。2结果RAPD标记对PCR反应条件有较高的要求，因此在实验前需要建立严格稳定的反应体系，以确保准确、稳定地扩增。将模板DNA浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、Mg2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数按单因素试验方案进行扩增实验，得到优化体系的结果。DNA浓度在PCR反应体系体积为20μl，引物浓度μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、Mg2＋浓度mmol/L、dNTPs浓度125μmol/L条件下，设定模板梯度，1，2，20，200，500，1000和2000ng/20μl，以确定适宜的模板浓度。结果见图1所示。从图1看出